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UE6 Initiation à la connaissance du m é dicament - Module « Pharmacologie g é n é rale » - Item « Paramètres de quantification des effets pharmacologiques.

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1 UE6 Initiation à la connaissance du m é dicament - Module « Pharmacologie g é n é rale » - Item « Paramètres de quantification des effets pharmacologiques » C Capdeville-Atkinson, C Perrin-Sarrado, N Gambier, F Dupuis, C Gaucher, G Trocklé Livres: «Pharmacologie : des cibles vers lindication thérapeutique», Yves LANDRY et Jean-Pierre GIES, Dunod, Paris 2009 «Initiation à la connaissance du médicament-UE6 1° année santé», Yves LANDRY, EdiScience, Dunod, Paris 2010

2 Plan 1. Interaction Ligand - Récepteur 1.1 Les 3 propriétés importantes 1.2 Notion de ligand, agoniste, antagoniste 1.3 Loi daction de masse 1.4 Théorie doccupation des récepteurs 2. Méthodes détude de linteraction Ligand - Récepteur 1.1 Approche fonctionnelle 1.2 Etude de liaison à haute affinité 3. Notion de sélectivité 4. CONCLUSION

3 1. Interaction Ligand - Récepteur

4 Affinité = traduit la puissance de linteraction physico-chimique entre le ligand et son récepteur = capacité de reconnaissance entre les 2 partenaires Réponse = effet ou activité du ligand suite à sa fixation sur le récepteur Sélectivité : - affinité préférentielle dun ligand pour un récepteur par rapport à un autre - liée à la concentration utilisée : « limportant, cest la dose » - production de médicaments de plus haute sélectivité Rapport effet primaire/effets secondaire - liaisons non covalentes (hydrophobes, ioniques, H, van der Walls) 1.1 Les 3 propriétés importantes

5 Sélectivité Transduction intracellulaire Réponse biologique effet Activité Couplage avec des effecteurs Affinité Cible (récepteur) médicament reconnaissance mutuelle des 2 partenaires 1.1 Les 3 propriétés importantes

6 récepteur Signal d'entrée affinité Système amplificateur Système effecteur effet Transduction Amplification Modulation Signal de sortie activité 1.1 Les 3 propriétés importantes

7 1.2 Notion de ligand, agoniste et antagoniste Ligand : toute molécule se liant à un récepteur Agoniste : molécule capable dengendrer, par sa liaison à ses récepteurs, une réponse biologique semblable à celle du médiateur endogène Antagoniste : molécule dont linteraction avec les mêmes récepteurs ne déclenche pas de réponse biologique et soppose à leffet du médiateur endogène

8 Cascade enzymatique - phosphorylations - déphosphorylations Réponse cellulaire - contraction - sécrétion - croissance et division - ….. AGONISTE Absence de signal intracellulaire Absence de réponse cellulaire Seconds messagers ANTAGONISTE 1.2 Notion de ligand, agoniste et antagoniste

9 Médiateur endogène 1.2 Notion de ligand, agoniste et antagoniste

10 1.2 Notion de ligand, agoniste et antagoniste Médicament agoniste : mime leffet du médiateur entier (réponse cellulaire maximale) partiel Médicament antagoniste neutre : - soppose à la liaison du médiateur à son récepteur - ninduit pas de réponse par lui-même mais leffet du médiateur endogène Médicament agoniste inverse : - soppose à la liaison du médiateur à son récepteur - entraîne une réponse opposée à celle de lagoniste

11 1.3 Loi daction de masse Modèle de la loi daction de masse - équilibre dynamique entre formes libres et associées du ligand et récepteur [L] + [R] [LR] k1k1 k -1 [L] :concentration molaire de ligand libre [R] :concentration molaire de récepteur libre [LR] :concentration molaire du complexe ligand-récepteur k 1 :constante cinétique dassociation (M -1 x min -1 ) k -1 :constante cinétique de dissociation (min -1 ) Notion déquilibre - modèle satisfaisant pour les études de base - constante déquilibre K (à une T°C donnée)

12 Vitesse dassociation = [L] x [R] x k 1 - nombre de formation du complexe ligand-récepteur par unité de temps A léquilibre : les 2 vitesses sont égales : [L] x [R] x k 1 = [LR] x k -1 ([L] x [R]) / [LR] = k -1 /k 1 = K D Affinité : inverse de la constante de dissociation : - 1/K A pour agoniste - 1/K B pour antagoniste K D : constante de dissociation à léquilibre (M) - K D dénommée K A pour agoniste - K D dénommée K B pour antagoniste Vitesse de dissociation = [LR] x k -1 - nombre de dissociation du complexe ligand-récepteur par unité de temps 1.3 Loi daction de masse

13 Affinité = 1/K A ou 1/K B = k 1 /k -1 = 1/K D En pratique : 1/K A et 1/K B = peu utilisées K A K B Ligands à forte affinité faible concentration pour se lier au récepteur (suggérant dose faible in vivo ) Plus K D est faible, plus laffinité est élevée K D = [L] nécessaire pour occuper 50 % des récepteurs à léquilibre grandeur de concentration unité = Molaire 1.3 Loi daction de masse

14 1.4 Réponse et théorie doccupation des récepteurs Affinité réciproque de L et R Formation du complexe LR Activité ou effet de L = Réponse de R Réponse cellulaire ou réponse de lorganisme

15 1.4.1 Théorie de loccupation des récepteurs (Clark) - Réponse proportionnelle au pourcentage de récepteurs occupés - Lorsque 100% des récepteurs occupés réponse maximale Récepteurs occupés (%) Effet (%) 1.4 Réponse et théorie doccupation des récepteurs

16 [A] + [R] [AR] k 1 k [A] : concentration molaire dagoniste libre [R] : concentration molaire de récepteur libre [AR]:concentration molaire du complexe agoniste-récepteur Réponse = [A]/([A]+K A ) Avec - [R tot ] = [R] + [AR] - K A = ([A] x [R])/[AR] 1.4 Réponse et théorie doccupation des récepteurs Loi daction de masse Réponse = [AR]/[R tot ] Si réponse % de récepteurs occupés Théorie doccupation des récepteurs

17 1.4.2 Evolution de la théorie de loccupation des récepteurs Ariens réponse maximale obtenue pour une gamme de concentration = différente dun agoniste à lautre facteur de proportionnalité propre à chaque agoniste : activité intrinsèque = capacité du ligand à stimuler le tissu Réponse = [AR] / [R tot ] = A/(A+K A ) = 1 :agoniste entier 0 < < 1 : agoniste partiel < 0 : agoniste inverse = 0 : antagoniste neutre 1.4 Réponse et théorie doccupation des récepteurs

18 Théorie doccupation des récepteurs complétée par Stephenson et Furchgott : - Réponse maximale faibles proportions de récepteurs occupés (2-20%) - notion de récepteurs de réserve = récepteurs libres alors que la réponse maximale est obtenue 1.4 Réponse et théorie doccupation des récepteurs

19 Conclusion : INTERACTION LIGAND - RECEPTEUR 3 propriétés :- Affinité - Réponse = Activité - Sélectivité Différents types de ligands : - Agoniste entier - Agoniste partiel - Antagoniste neutre - Agoniste inverse

20 2. Méthodes détude de linteraction Ligand - Récepteur

21 1) Approches fonctionnelles activité, affinité Objectif global : évaluation de lactivité, et de laffinité du médicament pour le récepteur responsable de leffet primaire et les récepteurs responsables des effets secondaires notion de sélectivité dun agoniste ou dun antagoniste Etude des ligands : 2 approches 2) Approches par liaison spécifique à haute affinité affinité, activité 2. Méthodes détude de linteraction ligand - récepteur

22 Les différents modèles détude de laffinité et de lactivité des médicaments

23 2.1 Approches fonctionnelles Expériences fonctionnelles préliminaires caractéristiques nouveau ligand - Si ligand = agoniste : observation dun effet propre du ligand en absence de médiateur endogène - Si ligand = antagoniste : pas deffet propre mais effet du médiateur endogène ou dun agoniste ajouté Suivant agoniste ou antagoniste, protocoles expérimentaux différents

24 réponses graduelles : augmentent progressivement en fonction de la dose ( in vivo ) ou de la concentration ( in vitro ). dose efficace 50 (DE 50 ) ou concentration efficace 50 (CE 50 ) : dose ou concentration nécessaire pour obtenir 50% de leffet maximal 2.1 Approches fonctionnelles agonistes Etude des agonistes

25 Réalisation dune courbe dose-réponse ou courbe concentration-réponse (doses ou concentrations cumulatives ) Contraction (g) Temps (minutes) M M M M M M M M 2.1 Approches fonctionnelles Etude des agonistes ex : courbe concentration réponse dun anneau aortique isolé

26 Détermination de E max, DE 50 ou CE 50 Dose ou Concentration linéaire dagoniste Effet Transformée en courbe sigmoïde Relation entre leffet (E) et la dose, ou entre leffet (E) et la concentration du médicament courbe dose-réponse ou courbe concentration-réponse : 2.1 Approches fonctionnelles Etude des agonistes

27 2.1 Approches fonctionnelles Etude des agonistes Transformation en courbe sigmoïde sur papier semi-logarithmique : M M M10 -6 M M [Agoniste] (molaire, M) Effet Effet max Effet = f([Agoniste] en Molaire) (ou = f(dose, en quantité/kg))

28 2.1 Approches fonctionnelles Etude des agonistes Transformation en courbe sigmoïde sur papier millimétré : Effet = f(- log [Agoniste]) [Agoniste] -log M Effet Effet max

29 2.1 Approches fonctionnelles Etude des agonistes Valeurs expérimentales non assimilables à constantes daffinité - Comparables entre labos si conditions expérimentales identiques CE 50 : concentration dagoniste produisant 50% de leffet maximal DE 50 : dose dagoniste produisant 50% de leffet maximal pD 2 = -log 10 (CE 50 ) (traduit laffinité, mais pas valeur daffinité absolue) : plus pD 2 élevé plus affinité forte Augmentation répartie sur 2 unités log Effet = f(- log 10 [A]) Effet -log[A] E max log(CE 50 ) E max /2

30 Détermination de lactivité : E max et notion dactivité intrinsèque -log[A] = 1 = 0,5 -logCE 50 Effet (%) C = Agoniste partiel A et B = Agonistes entiers 2.1 Approches fonctionnelles Etude des agonistes -logCE 50 A B C NB : CE50 A B et C CE50 B = CE50 C (affinités identiques)

31 Détermination de lactivité : E max et notion dactivité intrinsèque agoniste partiel (réponse maximale relativement faible) suggère changement de conformation partiel du récepteur et signalisation intracellulaire faible en présence dun agoniste entier, les agonistes partiels exercent en partie un effet antagoniste (donc par ex, attention à ladministration dun agoniste morphinique partiel (antalgique) chez un morphinoname = risque de précipiter un syndrome de manque) 2.1 Approches fonctionnelles Etude des agonistes -log[A] Effet (%) Agoniste partiel Agonistes entiers en partie effet antagoniste de C par rapport à A ou B si A ou B présents en même temps que C A B C

32 Antagonisme compétitif : liaison de lantagoniste sur le site de liaison de lagoniste Différents types dantagonisme : Antagonisme non compétitif : liaison de lantagoniste sur un site de liaison du récepteur distinct du site de liaison de lagoniste pas deffets propres étude par observation de la modification de leffet de lagoniste correspondant 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes

33 Antagonisme surmontable : déplacement courbe vers la droite sans diminution effet maximum pentes des courbes avec et sans antagoniste = parallèles Ex : cas des antagonistes compétitifs réversibles 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes Effet agoniste seul + antagoniste -log [agoniste]

34 Antagonisme insurmontable : diminution de leffet maximum de lagoniste Ex : cas des antagonistes non compétitifs 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes Effet -log [agoniste] agoniste seul + antagoniste

35 Détermination du pA 2 (ou pK B ) dun antagoniste Pour antagonisme surmontable compétitif pA 2 Etude de leffet de plusieurs concentrations (doses) dantagoniste sur la courbe concentration (dose)-réponse de lagoniste Déplacement vers la droite de la courbe concentration (dose)- réponse de lagoniste est fonction de laffinité de lantagoniste et de sa concentration (dose) 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes

36 Quantification de la réponse de lagoniste en absence et en présence antagoniste = fonction loi action de masse et théorie occupation des récepteurs Réponse identique si conditions identiques doccupation du récepteur par lagoniste 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes

37 En absence dantagoniste : Pour une concentration A dagoniste, une fraction des récepteurs A est occupée avec pour résultat un effet E 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes A + R ARAR Effet E A

38 Effet : E A ++ B + + RAR + BR A - fraction des récepteurs occupés par la concentration A dagoniste: A - Compétition entre A et B pour se lier à R effet pour la même concentration A dagoniste - Fonction des concentrations des ligands En présence dantagoniste : 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes en présence dantagoniste B et de la même concentration A dagoniste:

39 Pour occuper même fraction de récepteurs et obtenir même effet, il faut augmenter la concentration dagoniste A telle que A>A et A = A AR + + BR A ++ B + + R Effet E A= A A > A Effet : E A ++ B + + RAR + BR A 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes

40 En absence dantagoniste : A + R ARAR Effet E A AR + + BR A ++ B + + R Effet E A = A A > A Effet : E A ++ B + + RAR + BR A En présence dantagoniste :

41 rapport de concentrations de lagoniste occupant la même fraction de récepteurs et donnant le même effet en absence et en présence dune concentration dantagoniste = A/A = rapport des concentrations équi-actives log 10 ((A/A) – 1) = log 10 [antagoniste] – log 10 K B Représentation graphique : représentation de Schild = droite Calcul du rapport des concentrations équi-actives (ou rapport des doses équi-actives = « dose-ratio ») et représentation graphique de Schild 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes

42 Intersection de la droite de Schild avec axe des abscisses pA 2 pA 2 = - log de [antagoniste] (molaire) qui oblige à doubler la concentration dagoniste pour obtenir le même effet quen absence dantagoniste Plus le pA 2 est, plus laffinité de lantagoniste pour le récepteur lorsque log ((A/A) – 1) = 0 A/A = 2 log 10 ((A/A) – 1) = log 10 [antagoniste] – log 10 K B 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes

43 pA 2 Log 10 (A / A - 1) - log 10 [antagoniste] log 10 (a-1) log 10 (b-1) log 10 (c-1) Représentation graphique de Schild a a = A/A b b = A/A c c = A/A agoniste seul Effet [agoniste] A A A + antagoniste B : [B1] A A + antagoniste B : [B2] A A + antagoniste B : [B3] 2.1 Approches fonctionnelles Etude des antagonistes

44 permet caractériser laffinité dune nouvelle molécule synthétisée vis à vis de récepteurs connus détermination de K D permet caractériser les récepteurs dun tissu ou dune cellule en utilisant des ligands connus détermination de B max (nombre maximal de récepteurs) 2.2 Liaison spécifique haute affinité

45 2.2.1 Réalisation des études de liaison -Préparations subcellulaires : * homogénat * membranes * récepteurs purifiés ou cellulaires - Utilisation de ligand marqué = radioligand (L*) : 3 H, 14 C, 125 I - 3 étapes : incubation, séparation, mesure 2.2 Liaison spécifique haute affinité

46 L* récepteurs Séparation * * * * * * * * * L*R Mesure ** * Mélange scintillant Incubation * * * * * * * * * * 2.2 Liaison spécifique haute affinité radioligand L* en présence dune population de récepteurs (conditions précises de temps, pH, T°C) formation complexe L*R Centrifugation ou filtration séparation ligand libre L* et complexe L*R Radioactivité retenue sur le filtre quantification complexe L*R

47 Liaison non spécifique : liaison à sites de fixation autres que récepteurs - faible affinité - non saturable Liaison spécifique : liaison à des récepteurs - forte affinité - critère de saturabilité 2.2 Liaison spécifique haute affinité Mesure de la liaison totale = liaison spécifique + liaison non spécifique

48 Protocoles expérimentaux permettant de déterminer liaison spécifique Méthode par saturation Méthode par compétition 2.2 Liaison spécifique haute affinité

49 détermination de la liaison totale Première série dexpériences = concentration récepteur fixe et concentrations croissantes de ligand marqué (L*): Deuxième série dexpériences = tubes dans conditions identiques + surcharge ligand non marqué (L): - Compétition entre L et L* - L >> L* L en excès déplace L* des récepteurs (car nombre limité) - mais pas de compétition pour les sites de liaison non spécifiques (car nombre infini) détermination de la liaison non spécifique 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par saturation

50 Liaison du radioligand L*R [L*] liaison spécifique liaison non spécifique liaison totale Liaison spécifique = différence entre les 2 mesures 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par saturation

51 Avec densité de sites de liaison spécifique : [R t ] = B max = [R] + [L*R] Détermination de laffinité du ligand pour le récepteur : et loi daction de masse : K D = ([L*] x [R]) / [L*R] K D : [radioligand] requise pour occuper 50% des récepteurs K D = ([L*] x (B max – [L*R])) / [L*R] Si [L*R] = B max /2 K D = [L*] plus K D faible, plus laffinité du ligand est grande 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par saturation

52 - Nature hyperbolique de la liaison spécifique : - Transformation en régression linéaire : 1) Représentation de Scatchard 2) Représentation de Hill 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par saturation

53 Représentation de Scatchard détermination précise K D et B max (quantité totale de récepteurs dans la préparation) si conditions expérimentales strictes, suffisamment de points expérimentaux … B/F Pente = -1/K D B B max B /K D [L*R] = Bound = B [L*] = Free = F - ordonnée : B/F - abscisse B B/F = -1/K D x B + B max /K D 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par saturation

54 Représentation de Scatchard Ex : en augmentant le nombre de points expérimentaux, il est possible de « découvrir » une 2° population de récepteurs dans la préparation, sur lesquels le ligand radioactif se fixerait avec une affinité plus faible que sur la 1° population B/F Pente = -1/K du radioligand pour la 1° population de Rr D B B de la 1° population de Rr max B /K D 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par saturation B max /K D B de la 2° population de Rr max Pente = -1/K radioligand 2° population de Rr D

55 Représentation de Hill - ordonnée : log 10 (B/(B max -B) - abscisse : log 10 [L*] log 10 (B/(B max -B) = nlog 10 F-log 10 K D 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par saturation

56 - Pente de la droite n représente le nombre de Hill correspondant au nombre de sites par récepteur Si n = 1 : loi daction de masse vérifiée : 1 site de fixation pour le ligand population homogène de récepteurs Si n > 1 : présence de plusieurs sites daffinité différente pour le ligand population hétérogène de récepteurs Représentation de Hill Quantifier la déviation éventuelle de linteraction ligand récepteur de la loi daction de masse : 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par saturation

57 - Mise en présence dune concentration déterminée de récepteur [R] et de radioligand [L*] Affinité dun ligand non marqué pour son récepteur R proportionnelle au pouvoir de déplacement dun radioligand L* de caractéristiques (K D ) connues X se fixe sur le récepteur et déplace L* - Addition de concentrations croissantes ligand non marqué X à étudier radioactivité en fonction affinité de X et L* pour récepteur 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par compétition

58 Liaison spécifique à haute affinité : déplacement du ligand radiomarqué CI 50 - log [X] 50 % 100 % Liaison spécifique du radioligand [L*R] [R] fixe : * * * Radioligand [L*] fixe * * * [X] croissantes : * * * * * * 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par compétition * * *

59 CI 50 : concentration inhibitrice 50 = concentration de ligand non marqué qui inhibe 50% de la liaison spécifique du radioligand. Plus CI 50 faible, plus laffinité du ligand non marqué est grande 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par compétition

60 CI 50 dépend de la concentration et du K D de radioligands L* comparables uniquement dans des conditions expérimentales strictement identiques Ou : K I (équation de Cheng et Prusoff) : K I = CI 50 / (1 + ([L*] / K D )) 2.2 Liaison spécifique haute aff Méthode par compétition

61 K I : Valeur corrigée qui ne varie pas en fonction de la concentration ou du K D de L* assimilable à linverse de laffinité du ligand pour le récepteur. Dénominations K D et K I dépendent uniquement du protocole utilisé (saturation/compétition) ; leurs valeurs sont comparables. Méthode par compétition = la plus utilisée car pas de nécessité de radiomarquer la nouvelle molécule synthétisée : utilisation de banque de ligands connus radiomarqués 2.2 Liaison spécifique haute aff K D et K I

62 3. Notion de Sélectivité Sélectivité de leffet du médicament pour leffet recherché E1 vis à vis effet secondaire E2 = Rapport : Concentration ou dose effet E2 Concentration ou dose effet E1 CE 50 ou DE 50 Sélectivité dun ligand pour la cible R1 vis à vis de la cible R2 = affinité pour R2 affinité pour R1 Rapport : Notion essentielle à la connaissance dun médicament

63 Comparaison de la liaison spécifique dun ligand à 3 récepteurs R1, R2, R3 en fonction de la concentration du ligand > 100 Ligand sélectif de R1 par rapport à R3 < 10 Ligand non sélectif de R1 par rapport à R2 K D R3 K D R1 Rapport : = 1000 K D R2 K D R1 Rapport : = 3 3. Notion de Sélectivité (étude liaison spécifique haute affinité)

64 Sélectivité et marge thérapeutique dun médicament Effet -log[concentration] E max /2 Effet thérapeutique Effet indésirable CE 50 (ET) CE 50 (EI) Marge thérapeutique = (= espacement entre courbes) CE 50 (E Ther) CE 50 (E Ind) Plus la marge thérapeutique est élevée (= plus lespacement entre les courbes est grand, avec courbe « effet indés à droite de courbe effet thérap), plus la sécurité du médicament est importante 3. Notion de Sélectivité (approche fonctionnelle)

65 Que choisir pour bien comparer 2 ligands ? Comparer efficacité de divers agonistes sur un système expérimental unique CE 50 peuvent être comparées de manière fiable par méthode fonctionnelle Comparer affinité de divers ligands sur divers systèmes expérimentaux comparer les K D méthode de liaison spécifique à haute affinité CONCLUSION

66 Paramètres mesurés comparables dun labo à un autre ? (indépendamment des conditions expérimentales locales) Etudes fonctionnelles CE 50 / DE 50 non pD 2 non pA 2 (antagonistes compétitifs) pA2 assimilable à pK B plus ou moins Etudes de liaison à haute affinité KIKI oui KDKD CI 50 non (calculer K I )


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