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Dr. J. Galon Matthieu CAMUS INSERM U255 Dirigée par : Pr. H. Fridman Centre des Cordeliers Paris VI Outils Bioinformatiques pour lAnalyse du Microenvironnement.

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1 Dr. J. Galon Matthieu CAMUS INSERM U255 Dirigée par : Pr. H. Fridman Centre des Cordeliers Paris VI Outils Bioinformatiques pour lAnalyse du Microenvironnement Tumoral

2 Lymphocytes T Régulateurs, Lymphocytes B, NK, Macrophages … Lymphocytes T Régulateurs, Lymphocytes B, NK, Macrophages … Cellules présentatrices dAntigènes Lymphocytes T Effecteurs Lymphocytes T Effecteurs Cytokines Facteurs de croissance Chemokines Immunologie des Tumeurs Cellule Dendritique Micro-Environnement Tumoral -> analyses à Large-échelle pour létude des cellules infiltrantes Stroma Background Tumeur

3 FACS Phenotype Data (n=820) FACS Functional Data (n=980) DNA MicroArrays (n=12000) CIPHERGEN Collaboration SELDI-TOF (proteomic) Colon cancer : Approaches parameters patients ALPHELIS Collaboration Tissue MicroArrays (TMA) (1 marqueur cellulaire, deux régions) APPLIED Collaboration Taqman PCR LDA (n=48)

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5 Base de données (autorisation/authentification/CNIL) Gestion des données cliniques Gestion des données biologiques et expérimentales Modules de connections aux appareils de laboratoire Requêtes multicritères (listing, analyse) Connections aux autres bases (MARS, publiques) Connections aux logiciels danalyse (Genesis, PathwayExporer) Modules danalyses et statistiques

6 By B. Mlecnik & R. Molidor V1.5.2 (+ 20 versions) -> 1221 patients inclus -> plus de paramètres

7 Clinical info Material info (autorisation/authentification/CNIL) Connection PhAnS FAnS Pathways Ontology Pubmed MARS Databases ClueGO Knowledge Explorer ARACNe mapper Query Pathway Explorer Software Genesis Stats DATA TME v /12/2005

8 Phénotypage 50 marqueurs (Ac fluorescents) Acquisition (cytomètre) Tri (PhAnS 2.0) et stockage des données (TME.db) Analyses Statistiques (StatView, Excel) Clustering Marqueurs/Patients (Genesis) Phénotypage 50 marqueurs (Ac fluorescents) Acquisition (cytomètre) Tri (PhAnS 2.0) et stockage des données (TME.db) Analyses Statistiques (StatView, Excel) Clustering Marqueurs/Patients (Genesis) Exemple: Analyses FACS

9 CD3 CD8 SSC CD3 Analyses FACS (%) (MFI) (forme)

10 PhAnS2 Flow cytometry TME PHENOTYPIC ANALYSIS

11 Tri et stockage des données FACS 416 paramètres

12 Global representation of clustered marker expression values (% and MFI) 616 parameters 39 patients % MFI Genesis software -2+2

13 Patients (C) Non-tumoral Principal Componant Analysis (PCA) Patients (A) colon cancer Patients (B) colon cancer Healthy donnors (in vitro stimulation) Représentation et analyse des données FACS

14 Vers de nouvelles approches danalyse globale 1) Nouvelles méthodes de visualisation de groupes fonctionnels Intégration aux voies de signalisation (PathwayExplorer) Intégration aux données dontologie (ClueGO) 2) Analyse des réseaux dinteractions Analyse de reconstruction de réseau cellulaire (ARACNe) Analyse des interactions positive et négatives indirectes 3) Intégration automatique de la connaissance aux données Cartographie de la bibliographie (KnowledgeExplorer) (15 millions darticles scientifiques) Analyse en réseau de prédiction Analyses Bioinformatiques

15 ARACNe (algorithm for the reconstruction of accurate cellular networks) Nat Genet (4): Reverse engineering of regulatory networks in human B cells. Basso K, Margolin AA, Stolovitzky G, Klein U, Dalla-Favera R, Califano A.

16 Cancer Colorectal 4ème cause de décès dans le monde (environ décès par an) Un des cancers les plus fréquents Incidence Accrue (+40% ces 20 dernières années)

17 Background Le rôle de linfiltrat immunitaire dans le contrôle des étapes précoces de linvasion métastatique (VELIPI) est peu connu chez lhomme et pourrait avoir un impact important sur le devenir clinique des patients. VELIPI : venous emboli (VE) lymphatic invasion (LI) perineural invasion (PI)

18 Observations Préliminaires Analyses univariées de survie sur la population de patients (n = 959): VELIPI est un puissant facteur pronostic (p<10 -9 ) Survival (months) Overall Survival (%) [VELIPI ]=yes [VELIPI ]=no

19 Première Question Quelles sont les différences quantitatives et qualitatives de linfiltrat immunitaire entre les patients présentant des signes précoces dinvasion métastatique (VELIPI+) par rapport aux patients VELIPI-? Analyses de coupes de tissus Analyses FACS Analyses PCR (Applied-Biosystems).

20 TUMEUR Les patients VELIPI- presentent une fréquence accrue dinfiltrat immunitaire fort par rapport aux patients VELIPI+. Coupes de Tissus n=377

21 FACS : Cellules Totales P<0.05 VELIPI + VELIPI - * % positive cells Diminution significative de linfiltrat lymphocytaire T chez les patients VELIPI+. n=39

22 Taqman LDA Reponse Immunitaire Adaptadive Les patients VELIPI-/récidive- présentent des réponses immunitaires adaptative plus fortes Specific gene/18S RNA (%) IFN-g VELIPI Relapse CD8a GZM-B GNLY p<0.05 n = 75

23 Conclusions 1 Corrélation entre les réponses immunitaires adaptatives conduites par les lymphocytes T CD8 effecteurs et les patients VELIPI- qui ne subiront pas de rechute. Diminution significative de linfiltrat (lymphocytes T) chez les patients VELIPI+ par rapport aux patients VELIPI-.

24 Seconde question Les lymphocytes T effecteurs et effecteurs-mémoires sont-ils directement impliqués dans le contrôle des évènement métastatiques précoces? Analyses FACS Analyses des Tissue MicroArrays (TMA)

25 VELIPI -VELIPI + p<0.05 Marqueurs dexpression significativement differencielle (p<0.05) Entre les patients VELIPI- et VELIPI+ FACS CD45RO Mémoire

26 2 zones représentative du centre de la tumeur sont forées à partir de blocs de tissus inclus en paraffine Les carottes sont déposées dons un bloc récepteur, ensuite découpé pour effectuer des analyses immunohistochimiques (IHC). Tissue MicroArrays (TMA) CD45RO => 6640 IHC

27 CD45RO Analyse de spots de tissus tumoraux par Immunohistochimie (Spot Browser®, ALPHELYS) Tissue MicroArrays (TMA) Tissue CD45RO

28 TMA (n=415) Survival (months) CD45RO-hi CD45RO-lo p< % Survival Différences significatives de survie des patients en fonction de la densité (hi/lo) des lymphocytes T CD45RO+ mémoires infliltrés.

29 Conclusions 2 Cette étude à large-échelle indique un role positif des lymphocytes T effecteurs-mémoires dans le contrôle local de linvasion métastatique et le devenir clinique des patients.

30 Conclusions Finales Réseau Multidisciplinaire, approches, techniques, et bioinformatique : fonctionnel et efficace Validation du concept et de sa faisabilité La nature et la densité de linfiltrat immunitaire influencent les processus métastatiques précoces et le devenir clinique des patients atteint de cancers colorectaux.

31 fonctionnalité des lymphocytes infiltrant les tumeurs (activation, proliferation et migration) Perspectives Quelle est limportance de la coordination de la réponse immunitaire sur le pronostic clinique? 1) 2)

32 Equipe (INSERM U255, Cordeliers) Jérôme GALON, (CR) Franck PAGES, (MCU-PH) Anne COSTES, (Assistante-Ingénieur) Aurélia RODI, (Technicienne) Matthieu CAMUS, (4 ième année thèse) Amos KIRILOVSKY, (1 ière année thèse) Marie TOSOLINI, (1 ière année thèse) Pauline BERGER, (Stage Technicienne) Nicolas GOUGELET, (Stage Technicien) Wolf-Hervé FRIDMAN (PU-PH) Bioinformatic Laboratory (Graz) Robert MOLIDOR, (PostDoc) Bernhard MLECNIK, (Thèse) Thomas RAMSAUER, (Master) Fatima SANCHEZ-CABO (PostDoc) Zlatko TRAJANOSKI (PU) Departement de Chirurgie Digestive (HEGP) Anne BERGER (PU-PH) Paul-Henri CUGNENC (PU-PH) Collaborations Industries Applied-Biosystems (TaqMan-LDA) Ciphergen (SELDI-TOF protéomic) Alphelys (TMA) SISPIA (Informatics) Merci!

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