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Cours Spectrométrie de Masse Cours ESBS Oct 2010 Introduction Sarah CIANFERANI Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC) Laboratoire de Spectrométrie.

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1 Cours Spectrométrie de Masse Cours ESBS Oct 2010 Introduction Sarah CIANFERANI Institut Pluridisciplinaire Hubert Curien (IPHC) Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique Dir : Alain Van Dorsselaer UMR 7178 CNRS - Université de Strasbourg Tel:

2 Plan Mardi 12/10 : Théorie de la MS : Les Bases de la Spectrométrie de Masse - Introduction à la spectrométrie de masse - Lionisation MALDI - Lionisation Electrospray - La Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) Mercredi 13/10 : Utilisation de la MS en biologie - Utilisation de la spectrométrie de masse en analyse protéomique - La spectrométrie de masse des complexes non covalents

3 Définitions 1- Présentation dun spectre de masse 2- Unité de mesure: le Dalton 3- Masse moléculaire monoisotopique 4- Masse moléculaire moyenne (ou chimique) Linstrument : structure dun appareil de spectrométrie de masse 1-Structure dun instrument : source et analyseur 2- Rôle des champs lélectrostatiques 3- Rôle et systèmes de génération du vide 4- Présentation des principales sources EI, FAB, MALDI, ESI 5- Présentation des principaux analyseurs Magnétique, quadrupôlaire, trappe dion, TOF, FT-ICR 6- La MS-MS Spectrométrie de masse : introduction générale

4 Quest-ce que la spectrométrie de masse ? Cest une méthode de mesure des rapports masse-sur-charge (m/z) de molécules individuelles et ionisées (spectrométrie de masse moléculaire) ou de complexes non covalents ionisés (spectrométrie de masse supramoléculaire)

5 Historique 1912 : spectres de masse de O2, N2, CO, CO2, COCl2 (JJ. Thomson) 1930 : Application de la MS à la chimie organique (R. Conrad) 1948 : Principe de lanalyseur à temps de vol (TOF) (AE. Cameron) 1951 : Application de la résonnance cyclotron à la MS (H. Sommer) 1953 : Brevet pour lanalyseur à quadripôle et lion trap (W. Paul) 1958 : 1ers spectromètres de masse couplés à la GC (en 1975 : appareils GC-MS de routine) 1966 : Ionisation chimique (MSB. Munson et FH. Field) 1967 : introduction de linformatique !!!!!!!!!!!! 1981 : Ionisation par FAB (M. Barber) 1 er spectre complet de linsuline 5807 Da 1985 : Ionisation MALDI (F. Hillenkamp) 1989 : Ionisation Electrospray ESI (J. Fenn)

6 1- La masse moléculaire dun composé 2- La masse des fragments de ce composé 3- Une mesure de la quantité m/z Pic Moléculaire Fragments Nombre dions Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ?

7 1- La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire 2- Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure 3- Lintensité des pics permet de faire de lanalyse quantitative Fragments Quelles informations peut apporter la spectrométrie de masse ? Exemple: spectre en ionisation par impact électronique du cholestane.

8 Pic moléculaire et masse moléculaire : définition La masse moléculaire est déduite de la valeur m/z du pic moléculaire dans le spectre. Celui-ci correspond à un ion qui contient TOUS les atomes de la molécule étudiée, sans quil y ait eu rupture dune liaison. La molécule a été ionisée grâce à la perte ou au gain dune charge électrique. La masse moléculaire correspond donc à la composition élémentaire (formule brute) de lion moléculaire. Lexistence disotopes se traduit par la présence de plusieurs pics moléculaires. On observe, non pas UN pic moléculaire, mais UN GROUPE de pics moléculaires (un « massif moléculaire » ou « cluster moléculaire ») La présence disotopes complique donc la définition, et la mesure du « pic moléculaire ».

9 C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 Masse C 13 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 C 12 - C 13 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 C 12 - C 12 - C 13 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 13 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 C 12 - C 12 - C 12 - C 13 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 13 - C 12 - C 12 - C 12 C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 13 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 13 - C 12 - C 12 C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 13 - C 12 C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 12 - C 13 Pour cette molécule de 10 atomes de carbone, un atome de C13 peut être dans 10 positions différentes,mais la masse de la molécule est toujours la même. Masse M Masse M+1

10 Masse monoisotopique cest la masse du premier pic du profil isotopique cest-à-dire celle qui ne prend en compte que les masses des isotopes les plus stables (C 12, H 1, O 16, S 32, N 14, …). Masse chimique ou moyenne cest le barycentre (centroïde) des masses des pics constituant le profil isotopique cest-à-dire la masse qui prend en compte la masse des éléments donnée par le tableau périodique (C=12,011). Quelle masse mesure-t-on ?

11 Pic monoisotopique P P+1 P+2P+3 m/z Masse moyenne Quelle masse mesure-t-on ? Masse monoisotopique: dans le massif isotopique, on lappelle le pic P Les autres pics du massif isotopique sont appelés les pics P+1, P+2, P+3,…. Il contiennent tous au moins 1 des isotopes lourds dun éléments.

12 La résolution mesure laptitude dun analyseur à séparer lion M de lion M+ M Vallée à 10 % M M + M M R = M/ M De quoi dépend la nature de la masse mesurée ?

13 Pic monoisotopique P P+1 P+2P+3 m/z Masse moyenne Quelle masse mesure-t-on ?

14 Massif isotopique et résolution M = 246 Da M = 502 Da

15 Massif isotopique et résolution M = 1059 Da M = 2101 Da

16 Massif isotopique et résolution M = 4957 Da M = Da

17 Pour un peptide de 18 acides aminés, le pic monoisotopique nest déjà plus le pic majeur

18 La masse m sexprime en Dalton (Da) 1 Da = 1/ kgmole -1 / N (N = 6, ) Et donc:1 Da = 1, kg Quelle sont les unités de mesure ? C 12 = 12, C 13 = 13, H 1 = 1, H 2 = 2, O 16 = 15, S 32 = 31, N 14 = 14, Cl 35 = 34, Cl 37 = 36,

19 La sensibilité : combien de molécules peut-on détecter et mesurer ? 1 mole molécules 1 millimole molécules 1 micromole molécules 1 nanomole molécules 1 picomole molécules 1 femtomole molécules 1 attomole molécules 1 zeptomole molécules Quantités utilisées habituellement en SM

20 Un spectrométre de masse mesure la masse de molécules isolées Pour cela, le spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes: 1- Volatiliser Séparer les molécules les unes des autres: on passe de létat de matière condensée à un état gazeux. 2- Ioniser Transformer les molécules en ions, car un spectromètre de masse fonctionne grâce à des champs électriques 3- Mesurer les rapports m/z La masse moléculaire est calculée à partir du rapport masse (m)/nb de charges (z)

21 Principes de la MS Production dions en phase gazeuse Les ions sont ensuite séparés en fonction de leur masse ou plus précisément du rapport masse-sur-nombre de charges m/z Les ions sont ensuite détectés en proportion de leur nombre Système dintroduction de la substance à analyser SourceAnalyseur(s)Détecteur Ionise la substance à analyser Sépare les ions produits en fonction de leur rapport m/z Compte le nombre dions (chromatographie en phase gazeuse, liquide, électrophorèse, etc.) Système de traitement des données

22 Un spectromètre de masse est donc constitué de deux parties : 1- La source dion : pour volatiliser et ioniser Ces opérations peuvent se faire simultanément ou successivement selon le type de source dions. Leur mécanisme intime est souvent mal connu. 2- Lanalyseur: pour mesurer m/z Il mesure les valeurs du rapport: masse / nb de charge (appelé m/z) Cest une partie de lappareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur à la distance à parcourir dans lappareil pour atteindre le détecteur. CECI IMPLIQUE: Des champs électrostatiques très précis pour guider et déplacer les ions dans l'appareil (lentilles électrostatiques, optique ionique) Un vide suffisant pour que les ions puissent se déplacer sans être détruits ou déviés par des molécules résiduelles (notion de libre parcours moyen)

23 Les unités de mesures des pressions sont nombreuses. Lunité officielle est le pascal (Pa): 1 pascal = 1 N/m 2 On utilise également: Latmosphère1 atm = Pa (soit 1 013,25 hecto Pa) et 1 atm = 1,013 bar Le bar1 bar = 10 5 Pa (=10 6 dyne/cm2) Le millibar1 millibar = bar = 10 2 Pa Le Torr1 Torr = 1mm Hg Le Psi1 Psi = 1 pound / square inch = 0,07 atm et 14 PSI = 1 atm Pour la plupart des spectromètres de masse, le vide est indiqué en millibar. Les valeurs du vide dans lanalyseur sont en général: mbar :pour un analyseur trappe ionique (orbite circulaire) mbar :pour un analyseur quadripôlaire (1 mètre de long) mbar :pour un analyseur magnétique (2 à 3 mètres de long) mbar :pour un analyseur à temps de vol (2 à 3 mètres de long) mbar :pour un analyseur ICR (orbite circulaire).

24 Il existe de nombreux types de sources dions et chacun de ces types de sources repose sur un principe physique différent. Le principe physique qui permet de volatiliser et dioniser un type de composé est choisi par lopérateur en fonction des caractéristiques de la molécule à analyser. Les étapes de volatilisation et dionisation se font successivement ou simultanément selon le type de source. Les critères de choix principaux sont: la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser sa labilité chimique les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une ionisation la taille des molécules les quantités de produit disponibles le type dintroduction souhaitée (directe ou en couplage chromatographique) La source dions : son rôle est de volatiliser et dioniser

25 De très nombreuses méthodes dionisation ont été inventées pour ioniser et volatiliser des molécules de plus en plus fragiles, grandes et polaires. Les « ionisations dures » génèrent souvent des ions moléculaires qui se fragmentent beaucoup et parfois même totalement avant davoir eu le temps de sortir de la source. Leurs fragments peuvent être analysés et donnent des informations de structures. Les « ionisations douces » génèrent des ions moléculaires qui sont relativement stables et qui ont des durées de vie suffisantes pour traverser lanalyseur, arriver jusquau détecteur, et donc être mesurés. Les sources dions se classent en sources « dures » et en sources « douces »

26 1- La masse moléculaire dun composé 2- La masse des fragments de ce composé 3- Une mesure de la quantité Quelles informations peut apporter une source à ionisation dure ? Pic Moléculaire M/z Fragments Nombre dions

27 1- La masse moléculaire dun composé 2- Pas de fragmentation 3- Une mesure de la quantité Quelles informations peut apporter un soure à ionisation douce ? Pic Moléculaire M/z Nombre dions

28 Les Sources dIonisation les plus utilisées Ionisation à Impact électronique (IE) Ionisation Chimique (IC) Ionisation par bombardement dions ou datomes rapides (LSIMS ou FAB) Petites molécules volatiles et thermostables molécules < 6000 Da Biomolécules (1 300 kDa) et complexes non-covalents, protéomique Ionisation par électronébullisation (électrospray ES ou ESI) Désorption/Ionisation Laser assistée par Matrice (MALDI) DURES DOUCES ASSEZ DOUCES

29 Prix Nobel de chimie 2002 From the official Nobel press release : « Mass spectrometry is a very important analytical method used in practically all chemistry laboratories the world over. Previously only fairly small molecules could be identified, but John B. FENN and Koichi TANAKA have developed methods that make it possible to analyse biological macromolecules as well ».

30 Lanalyseur : pour mesurer m/z B:Déflexion par un champ magnétique (c'est l'analyseur le plus ancien) Q: Déflexion par un champ quadrupolaire IT: Confinement dans un piège à ion (Ion Trap) TOF:Mesure dun temps de vol (Time Of Flight) FT-ICR:Résonnance Cyclotronique dIons à Transformée de Fourrier Les ions formés dans la source sont dirigés (extraction et focalisation) vers lanalyseur par des champs électrostatiques qui peuvent être de quelques volts (Q, IT, FT-ICR) ou de plusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B). La vitesse de déplacement des ions dans lanalyseur dépend de lintensité du champ dextraction On peut coupler plusieurs analyseurs (MS-MS et MS n ) pour faire de la spectrométrie de masse à plusieurs dimensions en utilisant successivement le pouvoir séparateur de chaque analyseurs. Ceux-ci peuvent être identiques ou différents. Il existe différents types danalyseurs. Ils sont tous basés sur des principes physiques différents, mais tous les analyseurs mesurent des valeurs m/z. Cest une partie de lappareil où règne un vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur à la distance à parcourir dans lappareil pour atteindre le détecteur.

31 Les caractéristiques principales d'un analyseur sont : La résolution R La gamme m/z qu'il peut analyser La rapidité de balayage en m/z La sensibilité La vitesse avec laquelle les ions le traversent Souvent, avec un même analyseur, on peut augmenter l'une de ces caractéristiques aux dépends des autres, mais seulement dans certaines limites. Chaque type d'analyseur a son "point fort".

32 Vallée à 10 % R = M/ M Résolution dun analyseur Vallée à 10 % Pour un pic : Résolution R détermine la finesse des pics et donc la capacité à distinguer des pics proches. Plus la résolution est élevée, plus le pic sera fin et plus il sera possible de distinguer des pics proches. M Vallée à 50 % = Largeur à mi-hauteur Entre deux pics : la Résolution R est la capacité à séparer deux pics distants dune différence de masse M ie aptitude dun analyseur à séparer lion M de lion M+ M

33 Caractéristiques des analyseurs AnalyseursRésolutionGamme m/z Quadripôle (Q) Magnétique (EB) Temps de vol (TOF) Trappe ionique Cyclotron à résonance des ions (FT-ICR)

34 Lanalyseur à temps de vol Analyseur : TOF Source : MALDI Ultraflex

35 Principe de lanalyseur TOF 25 kVolts 0 volts Départ Formation des ions par un bref tir laser (5 nano sec.) Détection Mesure du temps écoulé depuis le départ des ions Zone de vol libre daccélération Zone daccélération Cible Les ions sont expulsés de la source par paquets 2 régions principales : - une région daccélération des ions - une région libre de champ E

36 Principe : 1.Les ions sont formés ou échantillonnés en paquets et sont ensuite accélérés pour acquérir une énergie cinétique fixe. 2.A un ion de masse m et de charge z, une tension U est appliquée dans une zone dite zone daccélération. 3.Lion acquiert une énergie cinétique E c correspondant à une vitesse v : 4.Dans un tube de vol de longueur L, le temps de vol t (time of flight) ou durée du parcours est lié à la vitesse v et le temps de vol est égal a : Principe de lanalyseur TOF

37 Analyseur TOF Exemple : Longueur du tube de vol L = 1 m U = 3000 V z = 1 m 1 = 1000 uma m 2 = 1001 uma m 3 = 2000 uma m 4 = 2001 uma On a donc un temps de vol : t 1 = 41,5905 sec t 2 = 41,6113 sec t 3 = 58,8178 sec t 4 = 58,8325 sec t = sec = 14.7 nanosec t = sec = 20.8 nanosec

38 Lanalyseur TOF : Résumé Ces un analyseur pulsé : les ions sont envoyés par paquets ( quadripôle à balayage continu) Dans la pratique : gamme de masse illimitée (la limitation technique vient du détecteur) et résolution maximale jusquà (en général 20000). En général, résolution mono-isotopique Grande transmission : 90% des ions arrivent au détecteur ( quadripôle à balayage continu) Sensibilité très élevée des TOFs TOF = analyseur haute résolution

39 Lanalyseur quadripolaire Formé de quatre barres de métal parallèles (section hyperbolique) entre lesquelles les ions sont injectés avec une énergie cinétique de quelques électron volts. Un ion + sera attiré vers une barre -. Si le potentiel de la barre change de signe avant que lion ne soit déchargé sur la barre, alors lion change de direction. Cest un analyseur basé sur la « stabilité de la trajectoire » des ions entre les barres - +

40 Lanalyseur quadripolaire

41 Lanalyseur quadripolaire: Résumé Le quadripôle fait partie des analyseurs à stabilité de trajectoire Dans la pratique : gamme de masse jusque 4000 Da et résolution maximale jusquà En général, insuffisant pour résolution mono-isotopique, résolution unitaire = résolution suffisante pour distingué 2 masses différentes de 1 Da. Balayage à vitesse uniforme sur l'ensemble de la gamme de masse indépendant de l'énergie cinétique (au contraire du TOF). inconvénient : beaucoup de perte d'ions (trajectoire instable) et donc perte de sensibilité En mode RF : le quadripôle sert à focaliser la trajectoire des ions pour avoir une meilleure translmission quadripole = analyseur basse résolution

42 La trappe ionique La trappe ionique est constituée de 3 électrodes : - un électrode annulaire en forme de diabolo - deux électrodes quasi-hyperboliques Les ions entrent et sortent de la trappe par des orifices au niveau des électrodes chapeaux.

43 Les 5 éléments dune trappe ionique Electrode chapeau dentréeElectrode chapeau de sortie Electrode annulaire Bagues disolation

44 Schéma d un ES-trappe ionique Esquire (HP, Bruker) Principe : les ions de différents m/z sont présents simultanément dans la trappe et on cherche à les expulser en fonction de leur masse pour avoir un spectre ( quadripôle : on règle les potentiels de manière à navoir quun seul m/z qui traverse les barres)

45 Lanalyseur Trappe ionique : Résumé La trappe ionique fait partie des analyseurs à stabilité de trajectoire Dans la pratique : gamme de masse jusque 6000 Da et résolution maximale jusquà Principale limitation : capacité de piégeage des ions Avantage : permet de faire de la MS multiple MS n n 2 (pour le quadripôle n=2 seulement) Trappe ionique = analyseur moyenne résolution

46 Nouvelle génération de trappe : piège orbital Orbitrap Résolution> à m/z 400 Précision< 5 ppm Sensibilitésub-femtomolaire Vitesse1 scan/sec à resolution 4-5 scans/sec à resolution Thermo Oscillation axiale suit la relation Fréquences déterminées par transformée de Fourier Electrode extérieure en forme de tonneau, électrode centrale en fuseau Trajectoire des ions due à - rotation ωφ - oscillation radiale ωr - oscillation axiale ωz Spirales entremêlées autour de lélectrode centrale Makarov 46

47 Spectromètres de masse commerciaux: De nombreux couples source /analyseur sont possibles EI/CI FAB MALDI/LD ES/APCI Q BE TOF IT FT-ICR

48 Les analyseurs peuvent être couplés et agir de façon séquentielle. On parle alors de spectrométrie de masse à plusieurs dimensions Un premier analyseur sélectionne les ions avec un certain m/z On purifie donc un ion présent dans un mélange dion qui peut être très complexe Lion « purifié » est alors fragmenté dans une chambre de collision. Un deuxième analyseur mesure alors les m/z des fragments. Cest de la MS-MS (spectrométrie de masse en tandem) Si on répète lopération, on fait de la MS-MS-MS ou MS 3 Certain appareils permettent de faire de la MS 10 La MS-MS est un puissant outil de détermination de structure La spectrométrie de masse à plusieurs dimensions: Il y a plusieurs analyseurs qui se suivent

49 Principe de la MS/MS: étude dions fils MS1 MS2 Cellule de collision Détecteur Source Ions Ion parent Fragmentation (CID) Ions fils Spectre MS/MS Le premier analyseur ne balaye pas

50 Obtention dun spectre de masse MS/MS Spectre de masse MS Sélection de lion parent (précurseur) Spectre de masse MS/MS (fragmentation) m/z Intensité m/z Intensité m/z Intensité Rupture des liaisons les plus fragiles Obtention dinformations structurales

51 Principe de fragmentation dans la chambre de collision (Collision Induced Dissociation : CID) Cellule de collision V E c = E lab = ze V E cm = E lab m g / Mi + m g Mi, z mgmg m1m1 m2m2 m3m3

52 Les analyseurs MS n La MS-MS peut être réalisée par : Deux quadrupôlesQ-Q Un quadrupôle et un analyseur à temps de vol Q-TOF Deux analyseurs à temps de volTOF-TOF Un piège à ions (Ion Trapp) IT Une résonnance cyclotronique dion à transformée de FourrierFT-ICR La MS n peut être réalisée par : Un piège à ions (Ion Trapp) IT Une résonnance cyclotronique dions à transformée de FourrierFT ICR

53 Les énergies de la collision en MS/MS dépendent du type danalyseur utilisé. Collision haute énergie en keV EB/EB ou BEB EB/Q EB/TOF TOF/TOF TOF (PSD) Collision basse énergie en eV QQ Q-TOF IT FT-ICR On peut obtenir des schémas de fragmentation différents selon les énergies utilisées

54 MS/MS pour un appareil de type Q-TOF

55 Analyse MS et (MS) n dans une trappe ionique

56 Nomenclature des fragments peptidiques Fragments observés seulement en haute énergie CH RnRn CO NHCH R n+1 anan bnbn cncn xnxn ynyn znzn NH COOH dn, vn, wndn, vn, wn d n+1, v n+1, w n+1 Fragments observés en haute et basse énergie Bieman, Roepstorff, Fohlmann

57 x10 4 Intens , Spectre ESI-MS dun digeste trypsique (m/z=681) MS/MS

58 ESI-IT-MS-MS de lion [M+2H] 2+ à m/z=681 I/L A G E K D

59 Détermination de proche en proche d'un Tag G 57.0 G G 56.9 G A A 71.0 E E I/L E E S S 87.0 G G 57.0 Série Y T T T T Spectre MS/MS dun peptide de masse sur lESI-trappe (doublement chargé à m/z = 869.8) Interprétation dun spectre MS/MS F F 147.1

60 Interprétation dun spectre MS/MS Ion parent W D G A M E MH + -H 2 O I/L I/L F I/L PA S D GQ XXMEAWDGXXLLLFSDX Série y R PAGQ


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