La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Cours Spectrométrie de Masse Cours ESBS Octobre 2005 Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer)

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Cours Spectrométrie de Masse Cours ESBS Octobre 2005 Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer)"— Transcription de la présentation:

1 Cours Spectrométrie de Masse Cours ESBS Octobre 2005 Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer) CNRS - Université Louis Pasteur Strasbourg Tel: La Désorption Ionisation Laser Assistée par Matrice : le MALDI

2 Lionisation laser assistée par matrice Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) Première publication: Laser desorption ionisation of proteins with molecular masses exceeding Da, Karas M. and Hillenkamp F. Anal. Chem. 60, (1988) - génère des ions à une seule charge MH + (monochargé) - lionisation se fait sous pression - tolérance aux sels et détergents - principalement couplée à un analyseur TOF (Temps de Vol) : sensibilité : moles résolution : en routine, précision : 20 ppm

3 Elle se fait souvent par protonation dun site basique, par exemple sur un acide aminé comme K, R, (H) - Ionisation positive (le voltage de source est positif) : - Ionisation négative (le voltage de source est négatif): Elle se fait par perte dun proton, par exemple sur un acide aminé comme D, E Lionisation négative est moins sensible que le mode positif. Souvent utilisée pour DNA et RNA -NH 2 -NH 3 + -COOH -COO - Lionisation électrospray : Règles dionisation des biomolécules en ESI Les peptides et protéines contiennent de nombreux groupes basiques ou acides qui peuvent recevoir des charges positives ou négatives

4 Lionisation laser assisté par matrice: MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) Le MALDI est basé sur lutilisation dun composé (la matrice) qui absorbe à 337 nanomètres Lanalyte est dilué environ fois dans cette matrice Léchantillon est introduit dans le spectromètre après complète évaporation des solvants. Il ny a donc pas de couplage avec la chromatographie possible La source dions MALDI est principalement couplée à un analyseur à temps de vol (MALDI-TOF)

5 Principe de lanalyse MALDI-TOF 1.Co-crystallisation dune matrice et dun échantillon 2.Le dépôt cristallin est irradié par des impulsions laser 3.Désorption et ionisation des molécules de matrice et de léchantillon 4.Accélération des ions formés dans un champ électrique en source 5.Séparation des ions selon leur rapport m/z dans le tube de vol 6.Détection des ions et mesure du temps écoulé entre un T 0 et limpact sur le détecteur

6 Co-crystallisation de léchantillon et de la matrice photosensible Excitation des molécules de matrices par limpulsion laser Laser + Ionisation et désorption de léchantillon Principe de la désorption de léchantillon Limpulsion laser provoque localement un échauffement du dépôt et de micro- explosions Léchauffement entraîne des collisions et le transfert de charges de la matrice à léchantillon

7 1. Préparation du dépôt La qualité de lanalyse dépend en grande partie de la qualité du dépôt du couple échantillon matrice. Trois types de dépôts peuvent être utilisés dans lanalyse protéomique. - couche mince - goutte séchée - sandwich Le dépôt le plus fréquemment utilisé est celui dit en goutte séchée

8 Matrice à saturation dans lacétone Echantillon cristallisé avec la matrice H 2 O/TFA O,1% Protection du dépôt Echantillon déposé sur H 2 O/TFA O,1% Dépôt de léchantillon sur la matrice Incorporation de léchantillon dans les couches supérieures de la matrice Dépôt de léchantillon sur la goutte deau acide 1.Préparation du dépôt Dépôt en couche mince (thin layer)

9 MatriceEchantillon Matrice à saturation dans H 2 O/ACN Matrice à saturation dans H 2 O/ACN diluée X3 Mélange Dépôt MatriceEchantillon Mélange direct sur la cible Co-cristallisation échantillon matrice 2. Préparation du dépôt Dépôt en goutte séchée (dried droplet)

10 Avantages : Goutte séchée : rapide, résistant, lavage Couche mince : permet un lavage (sandwich), plus sensible ! Désavantages : Goutte séchée : mauvaise conservation Couche mince : conservation plus longue, nombre de tirs limités 1.Préparation du dépôt Comparaison des deux techniques de dépôts

11 1.Préparation du dépôt Dépôt de type Sandwich Couche de matrice à saturation dans lacétone (0,5 µl) H 2 O/TFA O,1% Protection du dépôt (0,7 µl) Echantillon (0,5-1 µl) Sur couche de matrice à saturation dans H 2 O/ACN (Pain) (Beurre) (Jambon) (Pain)

12 Sandwich Goutte séchée Goutte séchée 1/3 1. Préparation du dépôt Aspect de différents dépôt MALDI-TOF avec l -Cyano-4-HydroxyCinnamic Acid Couche mince

13 Préparation de léchantillon Lanalyse MALDI-TOF est une technique de spectrométrie de masse qui est relativement tolérante vis à vis des composés qui accompagnent généralement léchantillon à analyser. Cependant certains échantillons ne pourront être analysés quaprès un traitement préalable le rendant compatible pour lanalyse MALDI-TOF. La personne qui va réaliser lanalyse MALDI-TOF et qui nest pas la personne qui a préparé léchantillon doit poser un certain nombre de questions qui orienteront son choix pour la préparation de léchantillon.

14 Les questions : - type de molécule à analyser (choix de la matrice) - type déchantillon (gel, liquide, poudre) - nature des solvants accompagnants léchantillon - pH - présence de sels - présence de détergents Ces informations vont conditionner les traitements qui seront réalisés pour rendre léchantillon compatible pour lanalyse MALDI-TOF Préparation de léchantillon

15 ACN trop concentré (>30%) Solubilisation de la matrice et obtention dune goutte séchée après évaporation de lACN Analyse possible Tris HCl 0,1 M pH 8 Dissolution de la matrice due au pH basique de la solution. Analyse impossible SDS 0,1% Formation dune couche cristallisée de SDS Analyse impossible SDS pH 8 ACN Aspect du dépôt sandwich en présence de composés non compatibles avec lanalyse MALDI-TOF

16 Elimination des sels par lavage direct du dépôt Il est possible de « dessaler » un échantillon sur cible par un lavage direct de léchantillon à laide de 1 µl deau acidifiée par 1% de HCOOH. Ce type de lavage, sur un dépôt en goutte séchée ou en sandwich, permet un dessalage rapide de léchantillon sans quasiment aucune perte. Les sels sont solubilisés par leau, les peptides restent cristallisés avec la matrices. sels matrice échantillon H 2 O/HCOOH

17 1. Préparation du dépôt Le choix de la matrice Caractéristiques de la matrice 1.Petit composé organique, photosensible (cycle aromatique) 2.Faible volatilité (10 -7 mbar) 3.Compatible avec le solvant de lanalyte (soluble) 4.Bonne absorbance à la longueur donde du laser (337 nm) 5.Capable de transférer une ou plusieurs charges à lanalyte (acide) La matrice est un point important dans lanalyse. Son choix peut conditionner la réussite ou léchec de lanalyse

18 2. Les matrices -Cyano-4-HydroxyCinnamic Acid (HCCA) 2,5-DiHydroBenzoic acid (DHB) Sinapinic Acid (SA) Absorbance à 337 nm Cristallisation aisée Solubles dans les solvants organiques Trois matrices permettent de réaliser une grande partie de analyses surtout dans le domaine de la protéomique.

19 MatriceType déchantillon -cyano (HCCA) Acide sinapinique (SA) Acide Dihydroxybenzoïque (DHB) Peptides / Protéines / Glycoprotéines Protéines / Glycoprotéines / Polymères polaires Peptides / Peptides Glycosylés, Phosphorylés Polymères polaires / Glycannes HCCA + DHB Peptides (Ref) 2. Les matrices Matrices usuelles et types déchantillons

20 2. Les matrices Structures dautres matrices Picolinic acid (PA) 3-Hydroxypicolinic acid (HPA) (Oligonucléotides) Caffeic acid 2,4,6- Trihydroxyacetophenone (THAP) (Oligonucléotides) 2-(4-Hydrophenylazo)benzoic acid

21 Matrice Type déchantillon THAP HPA Dithranol Oligonucléotides Polymères apolaires / Molécules organiques diverses Le point commun entre lensemble de ces différentes matrices est la présence dun noyau aromatique ainsi que leur caractère acide. 2. Les matrices Autres matrices et types déchantillons

22 Type déchantillon Léchantillon peut se présenter sous trois formes - Solide (poudre, cristal) - Liquide (solution) - Gel (électrophorèse) La forme sous laquelle se présente léchantillon va orienté son mode de préparation pour lanalyse MALDI-TOF. Généralement, les échantillons destinés à lanalyse « protéomique » se présentent inclus dans un gel. Léchantillon sous forme de gel est le plus facile à traiter. Léchantillon sous forme liquide réserve souvent des surprises et nécessite un traitement qui peut être plus difficile.

23 L'ionisation MALDI est, par principe, naturellement couplée à un analyseur à temps de vol (TOF). 20 kVolts 0 volts Départ: Formation des ions par un bref tir laser (5 nano sec.) Détection: Mesure du temps écoulé depuis le départ des ions Zone de vol libre daccélération Zone daccélération Cible

24 Analyseur à temps de vol source détecteur Ions positifs (m/z) V = + 30 kV -20 kV d La mesure du temps permet de calculer m/z, et donc la masse

25 Le mode linéaire permet danalyser les masses élevées MALDI - LR linear mode - intact protein mixture Cytochrome c Myoglobin Trypsinogen

26 Différents modes de fonctionnement dun spectromètre de masse à temps de vol 1- Le spectromètre de masse à analyseur TOF peut travailler: - sans réflectron (mode linéaire) - avec réflectron - avec ou sans extraction retardée des ions 2- Selon le mode de fonctionnement choisi (4 combinaisons possibles) les performances seront différentes pour: - la résolution - la sensibilité - la mesure des masses moléculaires élevées

27 Extraction retardée Cible 20 kV 15 kV 0 kV Lentille 1 Lentille 2

28 Cible 20 kV 15 kV 0 kV Bref tir laser (3 à 7 nano sec) Plasma Lentille 1 Lentille 2 Extraction retardée

29 Cible 20 kV 15 kV 0 kV Ions avec des énergies Cinétiques dispersées Et des t0 différents Vers le TOF Lentille 1 Lentille 2 Extraction retardée

30 Cible 20 kV 20,5 kV 0 kV Ions avec des t0 resynchronisés Vers le TOF Extraction retardée Lentille 1 Lentille 2 Extraction retardée

31 Lextraction retardée Potentiel lentille 2 (K volts) Temps Tir laser 20,5 15 Délai Le délai doit être optimisé (50, 100, 300 nanosecondes) en fonction des masses moléculaires étudiées (gamme 5000, 20000, daltons). Délai permet une focalisation en temps. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry M. L. Vestal, P. Juhasz, S.A. Martin, Rapid communication in mass spectrometry 9, , (1095) 2em départ (synchronisé)

32 source détecteur Ions positifs (m/z) V = + 3 kV -20 kV réflectron - 3 kV 130 V Réflectron Le réflectron permet daugmenter la résolution Il y a focalisation en énergie cinétique et allongement du tube de vol

33 Un appareil MALDI-TOF linéaire avec DE MALDI LR-Linear mode (Micromass) Effective flight path = 1.0 m

34 Effective flight path = 2.3 m Un appareil MALDI-TOF à réflectron avec DE MALDI-LR Dual Detector Reflectron mode (Micromass)

35 Réflectron

36 Linear mode ACTH resolution >7000 FWHM Reflectron mode ACTH resolution >15,000 FWHM Influence du reflectron sur la résolution Dual Detector Reflectron mode (Micromass)

37 Avantages apportés par le réflectron et par l'extraction retardée.

38 Spectre de masse MALDI des glycopeptides et de la sous-unité b de la hFSH

39 Méthodologie MALDI-MS de détermination de la spécificité dune enzyme

40

41 Spécificité de la cathepsine G sur la chaîne B oxydée de linsuline bovine

42 Spectre de masse MALDI de laérolysine heptamère : MM = Da

43 Préparation de léchantillon inclus dans un gel « Digestion in gel » - prélèvement du spot - lavage par NH 4 HCO 3 /ACN (50/50) X 3 - déhydratation par de lACN - réduction DTT (57°C 45 min.) - alkylation Iodoacétamide (30 min.) - lavage ACN - lavage par NH 4 HCO 3 /ACN (50/50) X 2 - déhydratation par de lACN - digestion enzymatique (12 H 37°C) NH 4 HCO 3 : 25 mM (98,5 mg/50 ml) DTT : 10 mM (15,4 mg/10 ml) Iodoacétamide : 55 mM (102 mg/10 ml) Trypsine Proméga V5111 : 12,5 ng/µl

44 Préparation de léchantillon inclus dans un gel « Digestion in gel » Lavage par NH 4 HCO 3 /ACN (50/50) (10 min) Déhydratation ACN Réduction (57°C_45 min) Déhydratation ACN Digestion à la trypsine (37°C, 12 heures) Lavage par NH 4 HCO 3 /ACN (50/50) (10 min) Alkylation (25 min)

45 La digestion « in gel » est une technique relativement simple, ce nest quune succession de lavages, mais des précautions sont tout de même indispensables. Le risque principal est la présence de protéines contaminantes en concentration supérieure à celle de la protéine à identifier. Le principal contaminant est la kératine qui est une protéine présente au niveau de la peau, des cheveux, des pulls … Il est possible déviter cette contamination par la kératine en prenant quelques précautions lors du traitement de léchantillon Préparation de léchantillon inclus dans un gel « Digestion in gel »

46 Goutte séchée 1/3 Résolution : Spectre MALDI-TOF dun digeste trypsique dADH (100 fmol ADH) Résolution Isotopique

47 La peak liste est utilisée pour faire les recherches dans les banques de données par le biais de différents moteurs de recherche (MS-Fit, Mascot, GlobalServer, Profound, PeptideSearch,…) Identification Liste des masses mesurées par MALDI-TOF

48 Résultats de la Recherche MASCOT

49 1 - Le MALDI génère des ions monochargés. 2 - Lionisation par MALDI est très douce. On observe que les ions moléculaires ne fragmentent pas. 3 - Le MALDI nest pas compatible avec le couplage LC-MS 4 – Les spectromètres de masse MALDI-TOF sont très sensibles (femtomoles voire attomole) 5 – MALDI utilisé en analyse protéomique pour lobtention de cartes peptidiques massiques (« peptide mass fingerprinting ») A retenir à propos de lionisation par MALDI


Télécharger ppt "Cours Spectrométrie de Masse Cours ESBS Octobre 2005 Sarah SANGLIER Laboratoire de Spectrométrie de Masse BioOrganique UMR 7512 (Dir : Alain Van Dorsselaer)"

Présentations similaires


Annonces Google