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Identification, production and purification - TAP tag/MS foot-printing - Single gene expression and in vitro assembly: - Co-expression techniques in E.

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1 Identification, production and purification - TAP tag/MS foot-printing - Single gene expression and in vitro assembly: - Co-expression techniques in E. coli and in insect cells - Purification strategies Analysis of assembly processes - fluorescence methods - microcalorimetry - surface plasmon resonnance - NMR - equilibrium binding/allostery Size and shape - Dynamic Light scattering - SAXS and SANS - Analytical ultracentrifugation - non denaturing MS - Electron microscopy - thermodynamics: the essentials

2 Characterization Strategies for non-obligatory complexes Isolated components are available and pure/homogenous Association ? (biochemical analysis) Pull down Native gel eletrophoresis, EMSA Gel filtration AUC, SAXS, SANS Native MS, EM Thermodynamic parameters ?EMSA, ITC, spectroscopy, AUC, SPR….. Conformational homogeneity ? EM, SAXS, SANS, AUC, DSC….. Association ? (biophysical analysis )

3 Biochemical methods to detect association Native gels for protein-protein and protein-NA complexes - association of NR LDB and co-activator peptide - EMSA, filter binding assays - cross-link -[DNA] = const. -[protein] varies Kd by fitting to binding isotherm

4 Biophysical methods to detect and characterize association Thermodynamic parameters ? EMSA, ITC, spectroscopy, AUC, SPR….. Structure ? EM, SAXS, SANS, AUC, DSC, MS….. Fluorescence Calorimetry Surface Plasmon resonnance NMR (Bruno Kieffer, march 31th)

5 Isolated compounds availible (non obligatory complexes) Signal that is different for the free and associated compounds Principle Titration

6 Spectroscopic methods

7 The electromagnetic spectrum

8 Excitation (Absorption) Emission (fluorescence) h > h < Fluorescence

9 Applications in biology Intensité de fluorescence et temps de vie sont très sensibles à l'environnement (100x) => sondes Molécules inhibitrices (quenching) => sonde d'accessibilité temps de vie de l'état excité (10-9 s = 1 ns), permet de mesurer des mouvements (absorption s => molécule immobile) techniques de polarisation dépolarisation Transfert d'excitation (FRET) => mesure de distances entre chromophores

10 Natural fluorophores amino acids: W, Y, F Dyes

11 Protéine de 283 aa issue d'une méduse (Aequorea victoria), naturellement fluorescente. Chromophore : modification d'une séquence GYS lexc = 395 nm, 475 nm ; lemis = 504 nm GFP (green fluoresent protein)

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13 Split proteins for in vivo detection of protein-protein interactions Split GFP as a probe for detecting protein-protein interactions. Protein A and protein B are linked to the split VDE intein. Interaction between protein A and protein B induces the folding of N- and C- terminal halves of VDE and protein splicing occurs. The N- and C- terminal halves of GFP are linked together by a peptide bond to yield fluorescent GFP. Copyright (c) 2006, Ozawa lab.

14 The emission spectrum depends on the environment of the fluorophore Thermofluor: follow denaturation of proteins and stabilization upon ligand/DNA/peptide binding buried Tryptophane

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20 Fluorescence anisotropy one molecule (DNA, peptide or protein) is fused to a fluorophore measure static fluorescence anisotropy association results in an entity which rotates more slowly than the isolated fluorophore and results in less scrambling of polarized light

21 Fluorescence Polarisation Fluorescence is measured with a linearly polarized beam Vertical emission Horizontal emission

22 Rapid rotational diffusion Intensities of vertical and horizontal emission almost equal

23 Slow rotational diffusion Intensities of vertical and horizontal emission differ = Anisotropy

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25 Polarisation de fluorescence Loi de Perrin L'anisotropie de fluorescence est définie comme : En considérant que la probabilité d'excitation est proportionnelle à cos2(q), on peut montrer que la valeur maximum possible de l'anisotropie est : Dans la réalité, les valeurs de A0 sont inférieures, et : temps de vie de fluorescence temps de correlation de rotation

26 HAT CoA

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28 Peptide co-activator binding

29 Un fluorophore à l'état excité (D) peut transmettre son énergie à un autre (A) par transfert non- radiatif, à distance. –La fluorescence de D est partiellement éteinte tandis que celle de A apparaît. –Cet effet résulte d'une interaction entre les dipôles électriques de D et A. Conditions pour le transfert –La distance DA doit être relativement courte (effet en 1/r6) –Recouvrement des bandes d'émission de D et d'absorption de A. Fluorescence Resonnace Energy Transfer

30 Transfert de fluorescence On définit une constante de vitesse de transfert kT –r0 : distance de Förster, caractéristique du couple DA (distance pour laquelle on observe une efficacité de transfert de 50%) – tf : temps de vie du donneur en l'absence de l'accepteur L'efficacité de transfert est donné par : La distance DA peut être calculée :

31 In vivo - cells co-transfected with plasmids expressing CFP and YFP fusion proteins - interaction between A and B and its modulation by effectors CFP-A + YFP-B CFP-A YFP-B 410 nm In vivo and in vitro FRET analysis In vitro - HTP screening for compounds that inhibit A/B interaction

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33 Micro Calorimetry La manière la plus directe de mesurer les paramètres thermodynamiques: étude des échanges de chaleur G, H, S et Cp Energies mises en jeu faibles lors par exemple de processus dassociation Kd G° 10 –3 -17 kJ/mol 10 –6 -34 kJ/mol 10 – kJ/mol 10 – kJ/mol Utilisation de la calorimétrie longtemps limitée par le manque de précision des calorimètres Développements technologiques ont permis la production de calorimètres sensibles :seuils de détection de lordre de la cal/sec

34 Isothermal Titration Calorimetry (ITC) Technique permettant létude de processus résultant de laddition dun composant dans la cellule de mesure. (eg titration dune protéine par un ligand) Mesure les enthalpies de réaction: Anatomie dun microcalorimètre: - cellule contenant la macromolécule T=k - seringue contenant le ligand. Lorsque le ligand et la macromolécule interagissent, de la chaleur est absorbée ou dégagée selon que la réaction est endo ou exo thermique. Le système de régulation du calorimètre injecte ou absorbe de la chaleur pour maintenir la température constante. Le signal mesuré est une puissance électrique. Au cours dune expérience ITC, un "ligand" est titré dans une cellule contenant une solution de "macromolécule".

35 A intervalles de temps réguliers, du ligand est injecté dans la cellule de mesure. Les données brutes sont constituées par la courbe puissance échangée = f(t). Cette courbe est constituée par une série de pics (chaque pic correspondant à une injection). Laire de chaque pic représente la chaleur totale libérée pour linjection. Lorsque les sites de fixation du ligand sont saturés le signal diminue jusquà une valeur correspondant à la chaleur de dilution Les données brutes permettent daccéder à une isotherme de titration: chaleur échangée = f(rapport molaire ligand/macromolécule). Une expérience ITC

36 Fixation des sous unités E1 et E3 au PSBD core domain Protein Science (2002),11 : PSBD M E1 7.5 M E M H° n Kd

37 Differential Scanning Calorimetry (DSC) Dédié à létude de la stabilité thermique des molécules Equipé dun système de régulation permettant la mesure des échanges de chaleur (Q produite ou absorbée) entre les cuves « échantillons » et « référence » (contenant uniquement le tampon). Mesure lexcès de capacité calorifique présent dans la cuve échantillon Cp (mcal/mol/degré) = f(T). Dénaturation thermique des macromolécules: Tm, Cp, H dénaturation

38 Molécule dintérêt est dans la cuve de mesure. Dans la cuve de référence le tampon dans lequel se trouve la macromolécule. Au cours dune expérience on fait varier la température et on mesure lénergie à fournir à la cuve de mesure pour que cuves de mesures et de référence soit exactement à la même température. On mesure lexcès de capacité calorifique présent dans la cuve échantillon: Cp = f(T) RéférenceEchantillon T1 Q

39 As the protein is heated, it reaches a temperature at which a large amount of heat is suddenly absorbed, as the protein unfolds. The area under the curve represents the heat absorbed on denaturation. The temperature at the midpoint is the Tm of the protein. (Why would the Tm be dependent on the pH of the solution?) There are two Cp's evident. Cd is associated with the actual denaturation process and is analogous to the change in heat capacity observed in phase changes, such as solid to liquid water. Cp which is the difference in heat capacity between the denaturated and native state. As was the case for the transfer of benzene to water, the Cp for protein denaturation is also positive, suggesting that in protein denaturation, hydrophobes are transferred from the interior of the protein to water.

40 Cp = dH/dT= TdS/dT. (derived from from Maxwell's relationships). Cp = d( H)/dT = Td( S)/dT A positive Cp occurs when H and S are dependent on temperature, which is observed when a hydrophobe is transfer from a more nonpolar environment to water. A negative Cp is observed when hydrophobes in water are transferred to a more nonpolar environment: formation of a protein-protein or protein-NA interface

41 Formulation stability studies Macromolecule domain structure Chemical half-life determinations Determining thermal stability and reversibility Applications of DSC

42 Thermodynamics and structure IMFs: electrostatics, H-bonds, V der Waals, hydrophobic effect les acides aminés hydrophobes pointent vers lintérieur de la molécule les paramètres thermodynamiques peuvent être estimés à partir de la surface dinteraction ( Cp). Comment sa contribution est elle étudiée? - théoriquement en mesurant la surface accessible au solvant (25 cal/mol/Å 2 ) - expérimentalement en mesurant des différences de stabilité entre mutants ponctuels.

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45 Dans le cadre de relations structure-fonction, lutilisation de mutants ponctuels permet dévaluer quantitativement les contributions énergétiques des diverses interactions. Pour une interaction protéine/ligand, on mesure les Kd pour la protéine wt et différents mutants (qui naffectent que linteraction Étudiée). On en déduit la contribution des diverses interactions à la formation du complexe. Effets thermodynamiques des mutations Er complexé à loestradiol

46 wt: 3 interactions mt: 2 interactions P(wt) + L P(wt)-L P(mt) + L P(mt)-L rG° = rG° (mt) – rG° (wt) avec rG = -RTln ([P-L]/[P][L]) rG° (wt) rG° (mt) G°#0

47 Application à la Tyrosyl-tRNA synthétase Structure de lintermédiaire réactionnel [TyrRS-tyrosyl-adénylate] Modèle de létat de transition Mute les résidus impliqués dans la reconnaissance et la stabilisation de létat de transition Mesure les paramètres cinétique de lenzyme wt et des mutants (kcat Km) On en déduit les contributions énergétiques G = -RTln (kcat/K M ) des chaînes latérales des différents acides aminés à la stabilisation de létat de transition.

48 Differential scanning calorimetry (DSC) uses heat to measure the progress of a chemical or physical process which occurs over a range of temperatures. Processes DSC can measure include the relative stability of proteins and nucleic acids, the half-life of low molecular weight organic compounds, and temperature transitions of lipids and membrane components, among others. During a DSC experiment, a sample is heated over a range of temperature. At some point, the material starts to undergo a chemical or physical change that releases or absorbs heat. As the temperature increases, the process continues to completion. Théorie de létat de transition Enzyme = Catalyseur. Une réaction doit être thermodynamiquement possible Il faut que la vitesse de réaction ne soit pas nulle. A + B X P + Q K k v = dP/dt = k [X ] X : complexe activé en équilibre rapide avec A et B (X = A, B, E) K = [X ]/AB - RT ln [X ] = G v = k [A][B] exp(- G /RT)

49 G : différence dénergie libre entre A, B et X Rôle de lenzyme: diminuer G, ie la hauteur de la barrière dactivation G A+B (+Enz) P+Q (+Enz) X G G A + B X P + Q v = k [A][B] exp(- G /RT) Energie dactivation

50 On compare G pour différents mutants Interprétation de lEnergie dactivation G représente la variation dénergie libre standard associée à la formation du complexe activé, cest à dire à létat de transition. G peut être estimée à partir des paramètres cinétiques G = G (mt) – G (wt) G = -RTln (kcat/K M )

51 mtwtS Phe-34Tyr-34Tyr0.52 Gly-35Cys-35ATP1.14 Ala-51Cys-51ATP0.47 Gly-48Asn-48ATP0.77 Gly-48His-48ATP0.96 Ser-35Cys-35ATP1.18 Phe-169Tyr-169Tyr3.72 Gy-195Gln-195Tyr4.49 Gly-35Ser-35ATP-0.04 Ala-51Thr-51ATP-0.44 G = G (mt) – G (wt) (kcal/mol)

52 Etudes de Stabilité Les protéines existent généralement dans deux états: Etat natif: (N) - conformation (généralement) unique - chaîne repliée - protéine active biologiquement Etat dénaturé: (D) - chaîne dépliée - caractéristiques de pelotes statistiques - protéine inactive N D

53 Température: Les liaisons, de Van der Waals et électrostatiques sont déstabilisées à haute température (énergies de liaison exothermiques). pH: Généralement ionisation des chaînes latérales enfouies à des pH extrèmes. A pH élevé His, Tyr seront chargées négativement et auront donc tendance à pointer vers le solvant et donc déstabiliser la protéine. Constante di-électrique: affecte les interactions électrostatiques. Les paramètres qui gouvernent la stabilité des macromolécules Des additifs comme des sels ou des sucres (sucrose, glucose, glycerol....) peuvent stabiliser des protéines (conservation et conditionnement des protéines) T

54 Pour comprendre comment les structures tertiaires des macromolécules (protéines isolées ou complexes) il faut être capable de mesurer lénergie libre de dénaturation ( GH 2 0 ou Ke). A 25 ou 37 °C, les macromolécules sont en exclusivement sous forme Native et les constantes déquilibre sont souvent difficilement mesurables. En déplaçant léquilibre dans le sens de la dénaturation (pH extrêmes, agents chaotropes, températures) on accès expérimentalement à la constante déquilibre ou une énergie libre dans dautres conditions expérimentales. Puis, à laide dun cycle thermodynamique, on calcule GH 2 0 ou Ke. Agents chaotropes: Urée, Guanidinium Etudes de Stabilité

55 Systèmes modèles: petites protéines ou complexes de structures connues et pour lesquelles le processus de dénaturation est réversible (RNAses, Barnase, Lysozyme, Tryp/DNA....) Il faut disposer dune observable qui permet de suivre le processus de dénaturation en fonction par exemple de la concentration en agent chaotrope Lobservable peut être: - activité enzymatique - signal de fluorescence, CD - viscosité - déplacement chimique...

56 f N et f D fractions de protéine Native et Dénaturée y observable permettant de suivre la réaction On exprime f D, f N en fonction de y f N y N + f D y D = y f D + f N = 1 dou f D = (y - y N ) / (y D - y N ) Dans un système à deux états, la courbe de dénaturation f D = fonction ([dénaturant]) est une sigmoîde (coopérativité folding) On en tire K eq = [D] eq /[N] eq = f D /f N et G o = -RTlnK eq = -RTln[ f D /(1 - f D )] pour chaque concentration en dénaturant. N D Interprétation de la courbe de dénaturation

57 A partir des données de dénaturation, on peut calculer lénergie libre standard de dénaturation pour chaque concentration en agent chaotrope. N(H20) D(H2O) N(Urée) D(Urée) GH 2 0 G Gt°(N) Gt°(D) G = - Gt°(N) + GH Gt°(D) = GH Gt°(D) - Gt°(N) = GH Gt° = a –m* [Urée] En extrapolant à une concentration en urée nulle (et Gt° = 0) observation expérimentale GH 2 0 = a

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59 Exemple de la protéine Arc: étude des déterminants de stabilité dans le cas dune protéine dimérique Mutations ponctuelles Dichroisme circulaire N 2 2U

60 Etude de lenthalpie de dénaturation rH°(T) = rH°(To)+ cp(T-To) cp lié à la variation de la surface accessible au solvant.

61 Binding kinetics Since biological systems are not at equilibrium the rate of binding and dissociation is critical For a simple 1:1 interaction (A + B AB) Rate of dissociation –dAB/dt = k diss [AB] –where k diss is the dissociation rate constant (k off ) Rate of association – dAB/dt = k ass [A][B] –where k ass is the association rate constant (k on ) At equilibrium: dAB/dt = k ass [A][B] - k diss [AB] = 0 k diss [AB] = k ass [A][B] –k diss /k ass = [A][B]/[AB] –Since K D = [A][B]/[AB] it follows that –k diss /k ass = K D

62 Dissociation Any reaction of the form dAB/dt [AB] will be exponential so –i.e. [AB] t = [AB] o e -kdisst –k diss determined directly by curve fitting The half life (t 1/2 ) can be calculate as follows Since at the t = t 1/2 [AB] t /[AB] o = 0.5 = e -kdisst1/2 It follows that -k diss t 1/2 = ln 0.5 = Thus t 1/2 = 0.693/k off Dissociation of A from B Symbols are data, lines are fitted curves t 1/2

63 Association In most experimental system it is impossible to follow association alone in the absence of simultaneous dissociation For the simple interaction A + B AB d[AB]/dt = k ass [A][B] – k diss [AB] It can be shown that [AB] t = [AB] final (1- e -kobst ) where k obs = k ass [A]+k off Thus one needs to know the k off and the [A] to calculate the k on

64 Summary of affinity and kinetic constants biological interactions Interactionk on (M -1 s -1 )k off (s -1 )K D (M) Cell-cell recognition molecules Antibody/antigen Cytokine/receptor Enzyme/inhibitor (eg barnase/barnstar)

65 Factors affecting kinetics The association rate constant does not vary that much –Association requires two proteins to collide in the correct orientation and in the correct conformation –This will be similar for most proteins –The basic rate is about 10 5 M -1.s -1 –The rate can be accelerated by long range electrostatic forces Increased rate of collision Steer binding sites into correct orientation E.g. barnase/barnstar interaction The dissociation rate constant varies considerable and is responsible for most of the change in affinity constants –It is determined by the number and strength of bonds in the contact interface –Depends on size of interface and the degree of surface-shape and electrostatic complementarity

66 The BIAcore uses an optical method (surface plasmon resonance) to measure changes in refractive index. Macromolecules binding to a sensor surface leads to an increase in refractive index near the surface. Surface plasmon resonance

67 A BIAcore sensorgram

68 Sensorchips

69 FIN


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