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- thermodynamics: the essentials

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1 - thermodynamics: the essentials
Identification, production and purification - TAP tag/MS foot-printing - Single gene expression and in vitro assembly: - Co-expression techniques in E. coli and in insect cells - Purification strategies Analysis of assembly processes - fluorescence methods - microcalorimetry - surface plasmon resonnance - NMR - equilibrium binding/allostery Size and shape - Dynamic Light scattering - SAXS and SANS - Analytical ultracentrifugation - non denaturing MS - Electron microscopy

2 Characterization Strategies for non-obligatory complexes
Isolated components are available and pure/homogenous Pull down Native gel eletrophoresis, EMSA Gel filtration AUC, SAXS, SANS Native MS, EM Association ? (biochemical analysis) Association ? (biophysical analysis ) Thermodynamic parameters ? EMSA, ITC, spectroscopy, AUC, SPR….. Conformational homogeneity ? EM, SAXS, SANS, AUC, DSC…..

3 Biochemical methods to detect association
Native gels for protein-protein and protein-NA complexes - association of NR LDB and co-activator peptide - EMSA, filter binding assays [DNA] = const. [protein] varies Kd by fitting to binding isotherm - cross-link

4 Biophysical methods to detect and characterize association
Fluorescence Calorimetry Surface Plasmon resonnance NMR (Bruno Kieffer, march 31th) Thermodynamic parameters ? EMSA, ITC, spectroscopy, AUC, SPR….. EM, SAXS, SANS, AUC, DSC, MS….. Structure ?

5 Principle Isolated compounds availible (non obligatory complexes) Signal that is different for the free and associated compounds Titration

6 Spectroscopic methods

7 The electromagnetic spectrum

8 Fluorescence Excitation (Absorption) Emission (fluorescence)
hn > hn l < l

9 Applications in biology
Intensité de fluorescence et temps de vie sont très sensibles à l'environnement (100x) => sondes Molécules inhibitrices (quenching) => sonde d'accessibilité temps de vie de l'état excité (10-9 s = 1 ns), permet de mesurer des mouvements (absorption s => molécule immobile) techniques de polarisation dépolarisation Transfert d'excitation (FRET) => mesure de distances entre chromophores

10 Natural fluorophores amino acids: W, Y, F Dyes

11 GFP (green fluoresent protein)
Protéine de 283 aa issue d'une méduse (Aequorea victoria), naturellement fluorescente. Chromophore : modification d'une séquence GYS lexc = 395 nm, 475 nm ; lemis = 504 nm

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13 Split proteins for in vivo detection of protein-protein interactions
Split GFP as a probe for detecting protein-protein interactions. Protein A and protein B are linked to the split VDE intein. Interaction between protein A and protein B induces the folding of N- and C-terminal halves of VDE and protein splicing occurs. The N- and C-terminal halves of GFP are linked together by a peptide bond to yield fluorescent GFP. Copyright (c) 2006, Ozawa lab.

14 The emission spectrum depends on the environment of the fluorophore
Thermofluor: follow denaturation of proteins and stabilization upon ligand/DNA/peptide binding buried Tryptophane

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20 Fluorescence anisotropy
one molecule (DNA, peptide or protein) is fused to a fluorophore measure static fluorescence anisotropy association results in an entity which rotates more slowly than the isolated fluorophore and results in less scrambling of polarized light

21 Fluorescence Polarisation
Fluorescence is measured with a linearly polarized beam Vertical emission Horizontal emission

22 Rapid rotational diffusion
Intensities of vertical and horizontal emission almost equal

23 Slow rotational diffusion
Intensities of vertical and horizontal emission differ = Anisotropy

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25 Polarisation de fluorescence Loi de Perrin
L'anisotropie de fluorescence est définie comme : En considérant que la probabilité d'excitation est proportionnelle à cos2(q), on peut montrer que la valeur maximum possible de l'anisotropie est : Dans la réalité, les valeurs de A0 sont inférieures, et : temps de vie de fluorescence temps de correlation de rotation

26 HAT CoA

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28 Peptide co-activator binding

29 Fluorescence Resonnace Energy Transfer
Un fluorophore à l'état excité (D) peut transmettre son énergie à un autre (A) par transfert non-radiatif, à distance. La fluorescence de D est partiellement éteinte tandis que celle de A apparaît. Cet effet résulte d'une interaction entre les dipôles électriques de D et A. Conditions pour le transfert La distance DA doit être relativement courte (effet en 1/r6) Recouvrement des bandes d'émission de D et d'absorption de A.

30 Transfert de fluorescence
On définit une constante de vitesse de transfert kT r0 : distance de Förster, caractéristique du couple DA (distance pour laquelle on observe une efficacité de transfert de 50%) tf : temps de vie du donneur en l'absence de l'accepteur L'efficacité de transfert est donné par : La distance DA peut être calculée :

31 In vivo and in vitro FRET analysis
- HTP screening for compounds that inhibit A/B interaction In vivo - cells co-transfected with plasmids expressing CFP and YFP fusion proteins - interaction between A and B and its modulation by effectors CFP-A YFP-B CFP-A YFP-B 410 nm

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33 Micro Calorimetry Kd DG°
La manière la plus directe de mesurer les paramètres thermodynamiques: étude des échanges de chaleur DG, DH, DS et DCp Energies mises en jeu faibles lors par exemple de processus d’association Kd DG° 10 –3 -17 kJ/mol 10 –6 -34 kJ/mol 10 – 9 -51 kJ/mol 10 –12 -68 kJ/mol Utilisation de la calorimétrie longtemps limitée par le manque de précision des calorimètres Développements technologiques ont permis la production de calorimètres sensibles :seuils de détection de l’ordre de la mcal/sec

34 Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
Technique permettant l’étude de processus résultant de l’addition d’un composant dans la cellule de mesure. (eg titration d’une protéine par un ligand) Mesure les enthalpies de réaction: Anatomie d’un microcalorimètre: - cellule contenant la macromolécule T=k - seringue contenant le ligand. Au cours d’une expérience ITC, un "ligand" est titré dans une cellule contenant une solution de "macromolécule". Lorsque le ligand et la macromolécule interagissent, de la chaleur est absorbée ou dégagée selon que la réaction est endo ou exo thermique. Le système de régulation du calorimètre injecte ou absorbe de la chaleur pour maintenir la température constante. Le signal mesuré est une puissance électrique.

35 Une expérience ITC A intervalles de temps réguliers, du ligand
est injecté dans la cellule de mesure. Les données brutes sont constituées par la courbe puissance échangée = f(t). Cette courbe est constituée par une série de pics (chaque pic correspondant à une injection). L’aire de chaque pic représente la chaleur totale libérée pour l’injection. Lorsque les sites de fixation du ligand sont saturés le signal diminue jusqu’à une valeur correspondant à la chaleur de dilution Les données brutes permettent d’accéder à une isotherme de titration: chaleur échangée = f(rapport molaire ligand/macromolécule).

36 Fixation des sous unités E1 et E3 au PSBD core domain
Protein Science (2002),11 : DH° n Kd PSBD mM E mM E mM

37 Differential Scanning Calorimetry (DSC)
Dédié à l’étude de la stabilité thermique des molécules Equipé d’un système de régulation permettant la mesure des échanges de chaleur (Q produite ou absorbée) entre les cuves « échantillons » et « référence » (contenant uniquement le tampon). Mesure l’excès de capacité calorifique présent dans la cuve échantillon DCp (mcal/mol/degré) = f(T). Dénaturation thermique des macromolécules: Tm, DCp, DH dénaturation

38 Molécule d’intérêt est dans la cuve de mesure.
Dans la cuve de référence le tampon dans lequel se trouve la macromolécule. Au cours d’une expérience on fait varier la température et on mesure l’énergie à fournir à la cuve de mesure pour que cuves de mesures et de référence soit exactement à la même température. On mesure l’excès de capacité calorifique présent dans la cuve échantillon: DCp = f(T) Référence Echantillon dQ DT1

39 As the protein is heated, it reaches a temperature at which a large amount of heat is suddenly absorbed, as the protein unfolds. The area under the curve represents the heat absorbed on denaturation. The temperature at the midpoint is the Tm of the protein. (Why would the Tm be dependent on the pH of the solution?) There are two DCp's evident. DCd is associated with the actual denaturation process and is analogous to the change in heat capacity observed in phase changes, such as solid to liquid water. DCp which is  the difference in heat capacity between the denaturated and native state.  As was the case for the transfer of benzene to water, the DCp for protein denaturation is also positive, suggesting that in protein denaturation,  hydrophobes are transferred from the interior of the protein to water.

40 Cp = dH/dT= TdS/dT.  (derived from from Maxwell's relationships).
DCp = d(DH)/dT = Td(DS)/dT A positive DCp occurs when DH and DS are dependent on temperature, which is observed when a hydrophobe is transfer from a more nonpolar environment to water. A negative DCp is observed when hydrophobes in water are transferred to a more nonpolar environment: formation of a protein-protein or protein-NA interface

41 Applications of DSC Formulation stability studies
Macromolecule domain structure Chemical half-life determinations Determining thermal stability and reversibility

42 Thermodynamics and structure
IMFs: electrostatics, H-bonds, V der Waals, hydrophobic effect les acides aminés hydrophobes pointent vers l’intérieur de la molécule les paramètres thermodynamiques peuvent être estimés à partir de la surface d’interaction (DCp). Comment sa contribution est elle étudiée? - théoriquement en mesurant la surface accessible au solvant (25 cal/mol/Å2) - expérimentalement en mesurant des différences de stabilité entre mutants ponctuels.

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45 Effets thermodynamiques des mutations
Dans le cadre de relations structure-fonction, l’utilisation de mutants ponctuels permet d’évaluer quantitativement les contributions énergétiques des diverses interactions. Pour une interaction protéine/ligand, on mesure les Kd pour la protéine wt et différents mutants (qui n’affectent que l’interaction Étudiée). On en déduit la contribution des diverses interactions à la formation du complexe. Erb complexé à l’oestradiol

46 DDrG° = DrG° (mt) – DrG° (wt)
mt: 2 interactions wt: 3 interactions DrG° (wt) P(wt) + L P(wt)-L P(mt) + L P(mt)-L DrG° (mt) DG°#0 DG°#0 DDrG° = DrG° (mt) – DrG° (wt) avec DrG‡ = -RTln ([P-L]/[P][L])

47 Application à la Tyrosyl-tRNA synthétase
Structure de l’intermédiaire réactionnel [TyrRS-tyrosyl-adénylate] Modèle de l’état de transition Mute les résidus impliqués dans la reconnaissance et la stabilisation de l’état de transition Mesure les paramètres cinétique de l’enzyme wt et des mutants (kcat Km) On en déduit les contributions énergétiques DG‡ = -RTln (kcat/KM) des chaînes latérales des différents acides aminés à la stabilisation de l’état de transition.

48 Théorie de l’état de transition
Differential scanning calorimetry (DSC) uses heat to measure the progress of a chemical or physical process which occurs over a range of temperatures. Processes DSC can measure include the relative stability of proteins and nucleic acids, the half-life of low molecular weight organic compounds, and temperature transitions of lipids and membrane components, among others. During a DSC experiment, a sample is heated over a range of temperature. At some point, the material starts to undergo a chemical or physical change that releases or absorbs heat. As the temperature increases, the process continues to completion. Théorie de l’état de transition Enzyme = Catalyseur. Une réaction doit être thermodynamiquement possible Il faut que la vitesse de réaction ne soit pas nulle. A + B X ‡ P + Q K‡ k’ v = dP/dt = k’ [X ‡] X ‡ : complexe activé en équilibre rapide avec A et B (X = A, B , E) K ‡ = [X ‡]/AB - RT ln [X ‡] = DG‡ v = k’ [A][B] exp(-DG‡/RT)

49 Energie d’activation DG‡ DG  A + B X ‡ P + Q
v = k’ [A][B] exp(-DG‡/RT) G A+B (+Enz) P+Q (+Enz) X ‡ DG‡ DG DG‡ : différence d’énergie libre entre A, B et X ‡ Rôle de l’enzyme: diminuer DG‡ , ie la hauteur de la barrière d’activation

50 Interprétation de l’Energie d’activation
DG‡ représente la variation d’énergie libre standard associée à la formation du complexe activé, c’est à dire à l’état de transition. DG‡ peut être estimée à partir des paramètres cinétiques On compare DG‡ pour différents mutants DDG‡ = DG‡ (mt) – DG‡ (wt) DG‡ = -RTln (kcat/KM)

51 DDG‡ = DG‡ (mt) – DG‡ (wt)
(kcal/mol) mt wt S Phe-34 Tyr-34 Tyr 0.52 Gly-35 Cys-35 ATP 1.14 Ala-51 Cys-51 0.47 Gly-48 Asn-48 0.77 His-48 0.96 Ser-35 1.18 Phe-169 Tyr-169 3.72 Gy-195 Gln-195 4.49 -0.04 Thr-51 -0.44

52 Etudes de Stabilité Les protéines existent généralement dans deux états: Etat natif: (N) - conformation (généralement) unique - chaîne repliée - protéine active biologiquement Etat dénaturé: (D) - chaîne dépliée - caractéristiques de pelotes statistiques - protéine inactive N D

53 Les paramètres qui gouvernent la stabilité des macromolécules
Température: Les liaisons, de Van der Waals et électrostatiques sont déstabilisées à haute température (énergies de liaison exothermiques). pH: Généralement ionisation des chaînes latérales enfouies à des pH extrèmes. A pH élevé His, Tyr seront chargées négativement et auront donc tendance à pointer vers le solvant et donc déstabiliser la protéine. Constante di-électrique: affecte les interactions électrostatiques. T Des additifs comme des sels ou des sucres (sucrose, glucose, glycerol....) peuvent stabiliser des protéines (conservation et conditionnement des protéines)

54 Etudes de Stabilité Pour comprendre comment les structures tertiaires des macromolécules (protéines isolées ou complexes) il faut être capable de mesurer l’énergie libre de dénaturation (DGH20 ou Ke). A 25 ou 37 °C, les macromolécules sont en exclusivement sous forme Native et les constantes d’équilibre sont souvent difficilement mesurables. En déplaçant l’équilibre dans le sens de la dénaturation (pH extrêmes, agents chaotropes, températures) on accès expérimentalement à la constante d’équilibre ou une énergie libre dans d’autres conditions expérimentales. Puis, à l’aide d’un cycle thermodynamique, on calcule DGH20 ou Ke. Agents chaotropes: Urée, Guanidinium

55 Systèmes modèles: petites protéines ou complexes de structures
connues et pour lesquelles le processus de dénaturation est réversible (RNAses, Barnase, Lysozyme, Tryp/DNA....) Il faut disposer d’une observable qui permet de suivre le processus de dénaturation en fonction par exemple de la concentration en agent chaotrope L’observable peut être: - activité enzymatique - signal de fluorescence, CD - viscosité - déplacement chimique...

56 Interprétation de la courbe de dénaturation
fN et fD fractions de protéine Native et Dénaturée y observable permettant de suivre la réaction On exprime fD , fN en fonction de y fN yN + fD yD = y fD + fN = d’ou fD = (y - yN) / (yD - yN) Dans un système à deux états, la courbe de dénaturation fD = fonction ([dénaturant]) est une sigmoîde (coopérativité folding) On en tire Keq = [D]eq/[N]eq = fD/fN et DGo = -RTlnKeq = -RTln[ fD/(1 - fD)] pour chaque concentration en dénaturant.

57 DGH20 = a N(H20) D(H2O) N(Urée) D(Urée)
A partir des données de dénaturation, on peut calculer l’énergie libre standard de dénaturation pour chaque concentration en agent chaotrope. DGH20 N(H20) D(H2O) N(Urée) D(Urée) DGt°(N) DGt°(D) DG observation expérimentale DG = - DGt°(N) + DGH20 + DGt°(D) = DGH DGt°(D) - DGt°(N) = DGH20 + DDGt° = a –m* [Urée] En extrapolant à une concentration en urée nulle (et DDGt° = 0) DGH20 = a

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59 Exemple de la protéine Arc: étude des déterminants de stabilité dans le cas d’une protéine dimérique
Mutations ponctuelles Dichroisme circulaire N U

60 Etude de l’enthalpie de dénaturation
DrH°(T) = DrH°(To)+ Dcp(T-To) Dcp lié à la variation de la surface accessible au solvant.

61 Binding kinetics kdiss[AB] = kass[A][B]
Since biological systems are not at equilibrium the rate of binding and dissociation is critical For a simple 1:1 interaction (A + B  AB) Rate of dissociation dAB/dt = k diss[AB] where kdiss is the dissociation rate constant (koff) Rate of association dAB/dt = kass[A][B] where kass is the association rate constant (kon) At equilibrium: dAB/dt = kass[A][B] - kdiss[AB] = 0 kdiss[AB] = kass[A][B] kdiss/kass = [A][B]/[AB] Since KD = [A][B]/[AB] it follows that kdiss/kass = KD

62 Dissociation Any reaction of the form dAB/dt ∞ [AB] will be exponential so i.e. [AB]t = [AB]oe-kdisst kdiss determined directly by curve fitting The half life (t1/2) can be calculate as follows Since at the t = t1/2 [AB]t/[AB]o = 0.5 = e-kdisst1/2 It follows that -kdisst1/2= ln 0.5 = 0.693 Thus t1/2 = 0.693/koff Dissociation of A from B Symbols are data, lines are fitted curves t1/2

63 Association In most experimental system it is impossible to follow association alone in the absence of simultaneous dissociation For the simple interaction A + B  AB d[AB]/dt = kass[A][B] – kdiss[AB] It can be shown that [AB]t = [AB]final (1- e-kobst) where kobs = kass[A]+koff Thus one needs to know the koff and the [A] to calculate the kon

64 Summary of affinity and kinetic constants biological interactions
kon (M-1s-1) koff (s-1) KD (M) Cell-cell recognition molecules 105 1-10 Antibody/antigen 10-3 10-8 Cytokine/receptor 10-4 10-9 Enzyme/inhibitor (eg barnase/barnstar) 108 10-11

65 Factors affecting kinetics
The association rate constant does not vary that much Association requires two proteins to collide in the correct orientation and in the correct conformation This will be similar for most proteins The basic rate is about 105 M-1.s-1 The rate can be accelerated by long range electrostatic forces Increased rate of collision Steer binding sites into correct orientation E.g. barnase/barnstar interaction The dissociation rate constant varies considerable and is responsible for most of the change in affinity constants It is determined by the number and strength of bonds in the contact interface Depends on size of interface and the degree of surface-shape and electrostatic complementarity

66 Surface plasmon resonance
The BIAcore uses an optical method (surface plasmon resonance) to measure changes in refractive index. Macromolecules binding to a sensor surface leads to an increase in refractive index near the surface.

67 A BIAcore sensorgram

68 Sensorchips

69 FIN


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