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Biologie Moléculaire Travailler avec lADN. Sujets ADN Genomique vs. Vecteur ADN Genomique vs. Vecteur Purification dADN plasmidique Purification dADN.

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1 Biologie Moléculaire Travailler avec lADN

2 Sujets ADN Genomique vs. Vecteur ADN Genomique vs. Vecteur Purification dADN plasmidique Purification dADN plasmidique Enzymes de restriction Enzymes de restriction Cartes de restriction Cartes de restriction

3 ADN Genomique Genomique Prokaryote vs. eukaryote Prokaryote vs. eukaryote Circulaire ou linéaire Circulaire ou linéaire Un ou plus dun chromosomes Un ou plus dun chromosomes Extra-genomique Extra-genomique Vecteurs Vecteurs Plasmides Plasmides

4 Vecteurs Vs Plasmides Vecteur: Vecteur: Véhicule dADN permettant le clonage, le maintien et lamplification dune séquence dADN Véhicule dADN permettant le clonage, le maintien et lamplification dune séquence dADN Plasmides Plasmides Virus Virus Chromosomes Chromosomes Tous les plasmides sont des vecteurs Tous les plasmides sont des vecteurs Pas tous les vecteurs sont des plasmides Pas tous les vecteurs sont des plasmides

5 Plasmides Petites molécules dADN circulaires maintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotes ou procaryotes Petites molécules dADN circulaires maintenues et amplifiées chez des cellules eucaryotes ou procaryotes Amplification chez les bactéries Amplification chez les bactéries Utilisé en tant que vecteur pour le clonage ou lexpression dADN dintérêt Utilisé en tant que vecteur pour le clonage ou lexpression dADN dintérêt

6 Caractéristiques des Vecteurs Plasmidiques Sites de restrictions uniques pour le clonage Origine de réplication (Ori) Marqueur de sélection Gènes de résistance aux antibiotiques

7 Isolation dADN Buts Buts Isolation de lADN désiré Isolation de lADN désiré Chromosomique ou plasmidique? Chromosomique ou plasmidique? Retirer les autres composantes Retirer les autres composantes ADN chromosomique ou plasmidique? ADN chromosomique ou plasmidique? Protéines Protéines ARN ARN Produits chimiques Produits chimiques Sels, détergents, etc. Sels, détergents, etc.

8 Lyse cellulaire Lyse cellulaire Paroi et membrane Paroi et membrane Enzymatique Enzymatique Chimique Chimique Mécanique Mécanique Isolation de lADN désiré Isolation de lADN désiré Sédimentation différentielle Sédimentation différentielle Chromatographie Chromatographie Retirer les autres composantes Retirer les autres composantes Enzymatique Enzymatique Sédimentation différentielle Sédimentation différentielle Chromatographie Chromatographie Isolation dADN (suite)

9 Isolation dADN Plasmidique par Lyse Alcaline (E.coli )

10 Solutions Utilisées Sol. I – Tampon de suspension Sol. I – Tampon de suspension Tris HCl - Tampon, protège les acides nucléiques Tris HCl - Tampon, protège les acides nucléiques EDTA - Chélates Mg++, empêche les nucléases de fonctionner EDTA - Chélates Mg++, empêche les nucléases de fonctionner Sol. II – Solution de lyse Sol. II – Solution de lyse NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN NaOH - ^pH lyse cellulaire, dénature ADN SDS - dissous membranes, denture et lie protéines SDS - dissous membranes, denture et lie protéines

11 Solutions Utilisées (suite) Sol. III- Acétate de potassium Sol. III- Acétate de potassium Renaturation de lADN Renaturation de lADN Précipite SDS Précipite SDS Précipite ADN génomique et protéines Précipite ADN génomique et protéines Isopropanol / Éthanol Isopropanol / Éthanol Précipite acides nucléiques (plasmide et ?) Précipite acides nucléiques (plasmide et ?) Sels demeurent solubles Sels demeurent solubles TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase?? TE-RNase - Tris & EDTA encore; RNase??

12 Quantification de lADN Déterminer la Conc. dADN Déterminer la Conc. dADN A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL A260 de 1.0 = 50µg/mL ou 50ng/µL Déterminer la quantité dADN Déterminer la quantité dADN 1mL dune solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg ADN 1mL dune solution avec une A260 de 1.0 contient 50µg ADN 1µL dune solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng ADN 1µL dune solution avec une A260 de 1.0 contient 50ng ADN Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTION Ne pas oublier de prendre en considération le FACTEUR DE DILUTION

13 Enzymes de Restriction Clive les liens phosphodiester internes Clive les liens phosphodiester internes Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques Reconnaissent des séquences doubles brins spécifiques Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences Différentes endonucléases reconnaissent différentes séquences Reconnaissent des séquences palindromes Reconnaissent des séquences palindromes

14 Palindromes La même séquence est lue dans la direction 5» 3 sur les deux brins La même séquence est lue dans la direction 5» 3 sur les deux brins 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5

15 Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins! Les mêmes liens phosphodiesters sont clivés sur les deux brins! 5-G5-G 3-C3-CCTAG GATCC-3C-3 G-5G-5

16 Différentes Extrémités sont Générées 5-G5-G 3-C3-CCT GA AG TCC-3C-3 G-5G-5 Extrémités franches

17 Différentes Extrémités sont Générées Extrémités 5 protubérantes 5-G5-G 3-C3-CCTAG GATCC-3C-3 G-5G-5

18 Différentes Extrémités sont Générées Extrémités 3 protubérantes 3-C3-C 5-G5-GGATCC-3C-3 CTAGG-5G-5

19 Compatibilité des Extrémités O P O P Extrémités franches HO P OH P Compatible

20 Compatibilité des Extrémités Extrémités Protubérantes HO P OH P HO PO P Incompatible

21 Compatibilité des Extrémités Extrémités Protubérantes P-CTAG HO GATC-P OH Compatible P-CTAG OGATC-P O Appariement

22 Compatibilité des Extrémités Extrémités protubérantes P-TCCA HO GATC-P OH Incompatible P-TCCA HO GATC-P OH Appariement

23 Cartes de Restrictions

24 Cartes de restrictions Déterminer les positions des site des enzymes de restrictions Déterminer les positions des site des enzymes de restrictions Cartes dADN linéaires Cartes dADN linéaires Cartes dADN circulaires (plasmides) Cartes dADN circulaires (plasmides) Cartes dinsertions dans un vecteur Cartes dinsertions dans un vecteur

25 Approche 1. Déterminer si lADN a été digéré 2. La digestion est elle complète ou partielle? 3. Combien de coupures? 4. Déterminer les positions relatives

26 1.LADN est-il digéré? Comparez au témoin non digéré Quelles échantillons nont pas été digérés? 1 et 4 Quelles échantillons ont été digérés? 2 et 3 Échelle Témoin 1234

27 2.La digestion est-elle complète? Digestion complète Digestion complète Toutes les molécules dADN sont clivées à tous les sites possibles Toutes les molécules dADN sont clivées à tous les sites possibles Digestion partielle Digestion partielle Une fraction des molécules non pas été digéré Une fraction des molécules non pas été digéré Partielle non digéré Partielle non digéré Une fraction des molécules a été digéré, mais pas à tous les sites possibles Une fraction des molécules a été digéré, mais pas à tous les sites possibles Digestion partielle Digestion partielle

28 Digestion complète Digestion

29 Digestion partielle: partielle non digéré Digestion Non digéré

30 Digestion partielle Digestion partielle

31 La digestion est-elle complète ou partielle? Comparez au témoin Vérifiez lintensité des bandes Vérifiez les tailles Échelle Témoin 1234

32 3.Combien de coupures? Nombre de sites Nombre de sites ADN circulaire = nombre de bandes ADN circulaire = nombre de bandes ADN linéaire = nombre de bandes – 1 ADN linéaire = nombre de bandes – 1 4. Déterminer les positions relatives La taille des fragments représente la distance entre les sites La taille des fragments représente la distance entre les sites

33 Cartes dADN linéaires EnzymeFragments (Kb) HindIII3 et 4 SalI2 et 5 HindIII + SalI2 et HindIII 7.0 HindIII + SalI

34 Cartes dADN circulaires (plasmides) EnzymeFragments (Kb) BamHI2, 3 et 5 HindIII1 et 9 BamHI + HindIII1, 1.5, 2, 2.5 et

35 Cartes dinsertions Plasmide recombinant Site dinsertion Vecteur SCM

36 Approche 1. Déterminer la taille totale 2. Déterminer la taille de linsertion Taille totale – taille du vecteur Taille totale – taille du vecteur 3. Déterminer le site dinsertion dans le SCM 4. Déterminer quelles enzymes coupent dans linsertion 5. Cartographie en relation aux sites de positions connues

37 Cartes dinsertions EnzymeFragments BamHI7.7Kb EcoRI1.0, 3.0, 3.7Kb PstI2.0 et 5.7 XbaI2.7 et Taille totale 7.7Kb 7.7Kb 2. Taille de linsertion 7.7 – 2.7 = 5.0Kb 7.7 – 2.7 = 5.0Kb 3. Site dinsertion Génère 2 fragments dont un est la taille du vecteur Génère 2 fragments dont un est la taille du vecteur XbaI XbaI

38 Cartes dinsertions EnzymeFragments Coupures totales Coupures vecteur Coupures insertion BamHI7.7Kb 1 10 EcoRI1.0, 3.0, 3.7Kb 3 12 PstI2.0 et XbaI2.7 et Site dins ertion 0 Sites a cartographier

39 Cartographie de PstI : 2 et 5.7Kb Kb 2.0 Kb

40 Cartographie de EcoRI: 1, 3 et 3.7Kb P


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