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Profil de Croissance Virale 1 Éclipse Temps # de virus Infection Latence Lyse Rendement de lyse.

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1 Profil de Croissance Virale 1 Éclipse Temps # de virus Infection Latence Lyse Rendement de lyse

2 Rendement de Lyse Définition du rendement de lyse: – N o de virus générés par une cellule infectée suite à un cycle infectieux complet Paramètres: – La multiplicité dinfection (M.I.) est N o de virus infectieux disponible par cellule – La M.I. sert aussi à déterminer le N o de cellules infectées 2

3 Multiplicité dInfection 3 Nombre de cellules = 6 Nombre de virus = 4 M.I. = 4/6 = 0.67 Ou 4 sur 6 cellules seront infectées

4 Multiplicité dInfection 4 Nombre de cellules = 6 Nombre de virus = 10 M.I. = 10/6 = 1.6 Ou 6 sur 6 cellules seront infectées

5 Calcul de la M.I cellules sont exposées à 10 4 virus – Quelle est la multiplicité dinfection? 10 4 /10 8 = Virus/cellule Combien de cellules seront infectées? 10 4 cellules seront infectées Combien de cellules restent non-infectés? = approx cellules (et non 10 4 ) 5

6 Calcul du Rendement de Lyse 6 Nombre de cellules infectées = 4 Nombre de virus produit =10 Ou 10 virus/4 cellules Donc rendement de lyse = 2.5 virus produits/cellule

7 Calcul du Rendement de Lyse M.I.=0.0001; # de cellules = 10 8 ; Après 10 heures il y a 10 6 virus – Quel est le rendement de lyse? virus/cellule x 10 8 cellules = 10 4 virus ensuite le rendement de lyse est 10 6 /10 4 =100 virus/cellule – Quelle est la multiplicité dinfection après le premier cycle infectieux? 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est x 100 =

8 Calcul du Rendement de Lyse (suite) – Quelle est la multiplicité dinfection après le deuxième cycle infectieux? 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.01 x 100 = 1 – Quelle est N o de cycle infectieux total? 3 cycles – Combien de virus sont produit à la fin du dernier cycle infectieux? Rendement x nombre total de cellule = 100 x

9 Énumération et Typage des Virus Compte direct – Détermine nombre de virus totaux Essai de plages – Détermine nombre de virus infectieux Essai dhémagglutination – Détermine nombre total de virus – Possible seulement avec les virus hémagglutinant Qui possède lhémmaglutinine – Ex. influenza Infectieux et non infectieux Essai dinhibition dhémagglutination – Typage antigénique de virus hémagglutinants 9

10 Comptes Directs Coloration négative Microscopie électronique Ne distingue pas particules infectieuses de non-infectieuses Utile pour les virus qui ne peuvent pas être crus en laboratoire Utilise des billes à une concentration connue pour estimer le volume du champ de vision 10

11 Comptes Directs Viraux 11 Ajouter billes (10 4 /mL) Observer au microscope 10 billes dans un champ Donc un champ = 1µL 21 virus dans un champ Donc 21 virus/1µL = 2.1 X 10 4 virus/mL

12 Essai de Plages Infecter monocouches de cellules ou tapis bactériens avec différentes dilutions de virus Déterminer le nombre de plages pour chaque dilution – Chaque plage est le résultat dune seule cellule infectée par une seule particule virale 1 UFP 12

13 Les Plages Effet cytopathique localisé – Lyse cellulaire Chaque plage représente un foyer dinfection – Chaque foyer dinfection est initié par une cellule infectée 13

14 14 33 UFP/0.1ml dune dilution de Donc le titre de la suspension originale est: Facteur de dilution 9 mL milieu Préparation virale 3.3 X 10 6 UFP/mL

15 Essai dHémagglutination Mesure de la quantité minimale de virus requise pour agglutiner les globules rouges – 1 unité dhémagglutination (UHA) 15 Hémagglutination complète Hémagglutination partielle Pas dhémagglutination 1UHA< 1UHA 0 UHA

16 Essai dHémagglutination 16 1:8 1: virus Dilution Mélanger avec globules rouges Titre = 32 UHA 1:8 1: Vu de côté Vu du haut

17 Essai dInhibition dHémagglutination 17 Anticorps anti-virus présentAnticorps anti-virus absent Ac lie le virus Liaison du virus au GR inhibée Virus lient GR HémagglutinationHémagglutination inhibé

18 Points importants à connaître Cours_08 Nov 2013 Les cellules sanguines – Connaître les noms – Leur origine – Les fonctions – Lieu daction Phagocytose (les différentes étapes) Les deux cascades du complément (en détail) – Alterne – MB-Lectine (MBL) – Les sentiers communs et différents entre les 2 cascades – Comprendre comment les antigènes sont présentés aux Lymphocytes

19 Cellules sanguines 19 Cellule souche hématopoïétique Plaquettes Érythrocytes Éosinophile Neutrophile Mégacaryocyte Mastocyte Basophile Lymphocyte T Cellule NK Cellule dendritique Lymphocyte B Cellule progénitrice lymphoïde Cellule myeloïde progénitrice Monocyte Moelle Os Macrophage

20 Cellules Polymorphonucléaires - Granulocytes Cellules qui relâchent des granules – Enzymes digestives, antiseptiques et initiateurs de la réponse inflammatoire Neutrophile – Cellule phagocytaire (cellules qui mangent) – Une concentration élevée indique dune infection – Normalement ils restent dans système sanguin – Mais vont dans les tissus seulement sil y a infection dans le tissu Éosinophile – Phagocytaire pour les complexes antigènes/anticorps (étiquettes) – Combats les infections parasitiques – Impliqué dans les réactions allergiques Basophile (dans le circulation)/Mastocyte (dans les tissus) – Initie et amplifie la réponse inflammatoire 20

21 Cellules sanguines 21 Cellule souche hématopoïétique Plaquettes Érythrocytes Éosinophile Neutrophile Mégacaryocyte Mastocyte Basophile Lymphocyte T Cellule NK Cellule dendritique Lymphocyte B Cellule progénitrice lymphoïde Cellule myeloïde progénitrice Monocyte Moelle Os Macrophage

22 Leucocytes Non Granulaires Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique – Cellules phagocytaires – Relâchent les initiateurs de la réponse inflammatoire – Fait appel au système adaptatif (la 3 ème ligne) – Cellules présentatrices dantigènes (CPA) ou cellules professionnelles Molécule présentatrice - CMHII Cellules NK – Lymphocyte qui tue cellules infectées et tumorales 22

23 Cellules sanguines 23 Cellule souche hématopoïétique Plaquettes Érythrocytes Éosinophile Neutrophile Mégacaryocyte Mastocyte Basophile Lymphocyte T Cellule NK Cellule dendritique Lymphocyte B Cellule progénitrice lymphoïde Cellule myeloïde progénitrice Monocyte Moelle Os Macrophage

24 Processus de la Phagocytose 24 Reconnaissance PRR (TLR) – PMAP Opsonines Ingestion Formation de phagosome Fusion avec lysosome Phagolysosome Digestion/Destruction Enzymatique & Chimique Expulsion

25 Phagocytose - Conséquences Digestion enzymatique – Lysozyme, Lipases, Glycosidases, Protéases, Nucléases Destruction oxydative par radicaux libres Superoxide dismutase : 2O H 2 O à H 2 O 2 + O 2. Myéloperoxidase: Cl - + H 2 O 2 à hypochlorite (javel) Relâchement dinitiateurs de la réponse inflammatoire Synthèse et sécrétion de cytokines Présentation sur CMHII (CPA seulement) 25

26 Cellules NK Le CMHI est exprimé sur toutes les cellules sauf les neurones et les globules rouges Tue cellules qui nont pas ou peu de CMHI – Cellules infectées par des virus – Cellules cancéreuses Deux récepteurs de surface Récepteur inhibiteur (dominant sur le récepteur activateur) – Interagit avec CMHI des cellules nucléées Récepteur activateur – Interagis avec glycoprotéines induites par le stress 26

27 NK Action des Cellules NK 27 CelluleNK Cellule Infectée Récepteur inhibiteur Récepteur activateur CMHI Protéine activatrice Cellule Survie Cellule Infectée

28 Cascades du Complément La réponse innée comporte deux cascades – Alterne et MB-Lectine (MBL=Mannose Binding Ligand): Implique une collection de protéines sériques (libre dans le serum et inactives) – Protéines du complément: C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9 – Protéines accessoires: B et P – Lectine qui lie le mannose qui se trouve seulement chez les bactérie (Voie MBL) – Protéases: MASP-1 et MASP-2 Initié par la liaison à des composantes communes à une grande variété de bactéries: – Alterne: Liaison de C3b à lipide A, acide téchoïque – MBL: Liaison de MBL au mannose des capsules 28

29 C9C9 C9C9 Voie Alterne 29 Bactérie Gram Négative C3 + H 2 O + C3b Ba P B Bb C3 Convertase C3 C3a C3b C5 Convertase C5 C5a C5b + C6C7 Complexe CAM C3a C8 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 29

30 C9C9 C9C9 30 Voie de la MB-Lectine 30 Capsule Bactérienne C5b C6C7 C8 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 MBL MASP1 MASP2 C4 C4a C4b C2a C2 C2b C2a C3 C3a C3b C5 C5a C5b +

31 Conséquences des Voies du Complément Opsonisation (étiquettes indiquant que les pathogènes doivent être détruits) – Liaison de C3b et C4b sur la bactérie Bactéries, virus et parasites Anaphylatoxines (des alarmes) – C3a et C5a Activent granulocytes et monocytes – Relâchement dinitiateurs de la réponse inflammatoire – Dégranulation – Recrutement des autres cellules dans la région CAM (pore) – Lyse osmotique Bactéries Gram négatives – Permet lysozyme datteindre la paroi Parasites – Perte de solutés 31

32 Présentation & Activation La présentation par les CPA est faite seulement aux lymphocytes T a Reconnaissance par les paratopes des RCT appropriés des lymphocytes T a – Les CPA sécrètent des cytokines activatrices (substances solubles que agissent sur dautres cellules) – Amplification clonale des T a qui sont sélectionnées – Donc la réponse acquise est initiée! 32

33 Lymphocytes T A Récepteur cellulaire – RCT – Reconnaissance dépitopes non-soi présenté par le CMHII Modes daction: Sécrétion de cytokines pour – Activer dautres lymphocytes (Tc, B) et les CPA (Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique) 33 RCT T A CD4

34 Lymphocytes T A Un Lymphocyte T A possède des RCT avec un paratope capable de reconnaître un épitope associé au CMHII – Cette cellules reconnait seulement cet épitope toute sa vie – Elle ne pourra pas reconnaitre dautres épitopes Pour reconnaître un autre épitope on a besoin dun autre lymphocyte TA avec un paratope spécifique pour ce nouvel epitope – Cest la raison pour laquelle on a un répertoire élevé 34

35 T A CD 4 Présentation aux Cellules T A 35 CD4 TATA TATA TATA TATA TATA Amplification clonale RCT Paratope CPA CMHII T A CD 4

36 3 e Ligne-Le Système Adaptatif Caractéristiques: – Spécifique – Acquiert une mémoire après une première rencontre – Capable dapprendre et de saméliorer suite à des infections subséquentes – Contrairement ou système innée il fait la discrimination entre le soi et le non-soi 36

37 Deux Fronts 37 Extracellulaire Réponse Humorale Antigènes exogènes: – Bactéries – Virus – Mycètes – Parasites – Toxines Intracellulaire Réponse Cellulaire Antigènes endogènes: – Quelques bactéries Ex. Mycoplasmes Mycobactérium – Virus

38 Participants Cellulaires CPA – Lymphocytes B, monocytes, macrophages et cellules dendritiques Lymphocytes Ta (T auxiliaire) – TH1: Réponse cellulaire (contre antigène endogène) – TH2: Réponse humorale (contre antigène exogène) Lymphocytes B – Réponse Humorale (contre antigène exogène) Lymphocytes Tc – Réponse cellulaire (contre antigène endogène) 38

39 La Réponse Humorale 1.Choisir un lymphocyte B avec un RCB qui reconnait un épitope de lantigène – Cest la sélection clonale 2.Si lantigène se lie à la RCB, lendocytose du complexe RCB-Ag se fait 3.Ensuite il y a digestion du complexe RCB-Ag 4.Présentation dépitopes complexés sur le CMHII à des cellules TH2 avec RCT approprié préalablement activées – Donc cest la deuxième fois que la TH2 se fait présenter lAg 5.La TH2 secrète des cytokines pour activer le lymphocyte B 6.Ensuite lactivation du lymphocyte B fait lamplification clonale et se différence en plasmocytes et cellule B mémoire 39

40 Lymphocytes B Un Lymphocyte B possède un RCB capable de reconnaître un épitope avec un paratope Le RCB est formé de 2 isotypes danticorps – IgM & IgD membranaire Cest une molécule présentatrice – Donc elle possède un CMHII Les lymphocytes B secrètent aussi des molécules effectrices (Anticorps) – 5 isotypes: IgD, IgM, IgG, IgA, IgE 40 RCB IgM & IgD membranaire

41 La Réponse Humorale Les plasmocytes secrètent des anticorps – Une cellule peu seulement produire des anticorps avec un paratope (le même paratope que la cellule mère) – Elle ne peut pas changer le paratope ni lépitope quil reconnait Les cellules B mémoire gardent une mémoire pour lépitope – Cela fait aussi que la représentation de cette cellule est plus grande – Donc la prochaine réponse est plus rapide 41

42 La Réponse Humorale 42 Répertoire de lymphocytes B Naïf Antigène TH2 Activée Activation P P P P Plasmocytes M M B Mémoires Amplification clonale et différentiation Sécrétion dAc Épitopes CMHII RCB: IgM ou IgD Cytokines

43 Les Anticorps (Immunoglobulines) 43 Chaîne lourde Région variable Région constante Liens disulfures Chaîne légère Région variable Région constante Isotype Idiotype Sites de liaisons dépitopes antigéniques 2 X Fab 1 X Fc

44 Fab (Fragment Antigen Binding) – Région responsable de la reconnaissance de lépitope – Nest pas responsable de la fonction Fc (Fragment constant) – Région responsable de la fonction – Nest pas implique dans le reconnaissance 44 Les Anticorps (Immunoglobulines)

45 Immunoglobulines - Cinq Isotypes 45 IgD IgM IgG IgA IgE Les cellules B peuvent produire 5 isotypes ( Le mode daction des Ac est déterminé par lisotype) Mais seulement 1 idiotype ( resposable de la reconnaissance de lepitope ) Déterminé par la région Constante Confère fonctionnalité

46 IgD Monomère valence de 2 – Peut reconnaitre 2 molecules dun même epitopes Ac exclusivement membranaire – Pas secrété Ac de surface des cellules B Represente le RCB 46

47 IgM 47 Pentamère (valence de 10) Anticorps de surface RCB – Forme membranaire mais peut être secrété Premier Ac sécrété Fixation du complément Agglutinant Agit comme étiquette (ADCC) reconnue par cellules NK

48 IgG Monomère (valence de 2) Ac sérique prédominant – Plus abondant dans le sérum Le seul que peut traverser le placenta – Donc peu protéger le fétus Fait la fixation du complément Région Fc est une opsonine – Reconnue par phagocytes Agit comme étiquette (ADCC) reconnue par cellules NK 48

49 IgA Dimère (valence de 4) Principalement associé aux muqueuses – Dans les orifices (la bouche, le nez, lanus, etc..) Neutralisant et agglutinant 49

50 IgE Monomère – Secrété par les lymphocyte B Leurs régions Fc se lient aux membranes des macrophages, basophiles et mastocytes – Deviennent donc des Ac membranaires Impliqué dans les réactions allergiques – Ces cellules du système innée acquièrent des récepteurs qui les rendent spécifiques 50

51 Modes dActions des Anticorps 51 Agglutination Neutralisation Opsonisation ADCC Dégranulation des macrophages Fixation du complément – Voie classique du complément IgM et IgA IgM, IgA et IgG IgG et IgM IgE IgM et IgG

52 Agglutination 52 Favorise la phagocytose Inactive lenvahisseur

53 Neutralisation 53 Liaison à des composantes essentielles causant linactivation

54 Opsonisation par IgG ou IgM 54 Régions Fc dIgM et dIgG sont des opsonines reconnues par les cellules phagocytaire – Le lysozyme tue toute les cellules dans lenvironnement

55 ADCC 55 Régions Fc dIgM et dIgG sont reconnues par des récepteurs des cellules NK – La destruction est ciblée (tue les cellules ciblées)

56 Dégranulation des Mastocytes par les IgE 56 IgE Lysosome Granules de médiateurs préformés Récepteur de région Fc Allergène

57 Antigène (pas nécessairement une bactérie) Voie Classique du Complément 57 C1q C1rC1s Complexe C1 C4 C 4a C 4b + C 4b C2 C2a C2b + C5 Convertase C3 C3b C3a + C5b C6C7 C3b C3 Convertase C5 C5a C5b + C9C9 C9C9 C8 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9 C9C9

58 Conséquences de la Voie Classique Opsonisation – C3b & C4b Analphylatoxines – C3a & C5a CAM – Lyse osmotique 58

59 Décours de la Réponse Humorale 59 Rencontre avec Ag >30 Jours après lexposition Nombre de cellules B Spécifiques à lantigène Reconnaissance Présentation B naïve Élimination Immunité Mémoire B mémoire B activé Expansion Clonale Activation

60 Réponses Immunes: 1 re et 2 e Rencontres 60 Élément Réponse primaire Réponse secondaire Réponse maximalePlus faiblePlus forte Isotype dAc Habituellement commence avec IgM ensuite passe à IgG Augmentation des IgG (on passe directement à IgG) Nombre dantigène requis Relativement élevée Faible LatenceEntre joursEntre 1-3 jours

61 Types dImmunités Humorales 61 Naturelle ActivePassive Artificielle ActivePassive

62 Immun. Acquise Naturelle Active/Passive Exposition naturelle à lantigène – En général se fait de façon naturelle Ex. Une infection Défense humorale active: – Lindividu monte ses propres défenses – Mémoire acquise Défense humorale passive: – Réponse humorale chez hôte 1 – Transfert naturel des Ac de hôte 1 à hôte 2 – Pas de mémoire acquise Ex. IgG transmit dans le lait maternel 62

63 Immun. Acquise Artificielle Active/Passive Exposition artificielle à lantigène – En général se fait avec intervention humaine Ex. Vaccination, transfusion Défense humorale active: – Lindividu monte ses propres défenses – Mémoire acquise Défense humorale passive: – Réponse humorale chez hôte 1 – Transfère artificiel des Ac à un autre hôte Ex. Les antivenins; générés chez les chevaux et administré à lhomme – Aucune mémoire acquise 63

64 Pour des antigènes endogènes – Ag fabriqués à lintérieur de la cellule Ex. une cellule infectée par un virus et qui fabrique les protéines du virus à lintérieur Tout les antigènes endogènes sont présentés sur le CMHI Le CMHI présente les antigènes aux lymphocytes Tc 64 Réponse Acquise à Médiation Cellulaire

65 65 1.Choisir un lymphocyte Tc avec un RCT qui à le bon paratope pour reconnaitre un épitope de lantigène associé au CMHI dune cellule infectée – Sélection clonale 2.Activation du lymphocyte Tc – Armement par cellules TH1 préalablement activées Reconnaissance par RCT approprié dépitopes complexés au CMHII de CPA – Amplification clonale – Tuer cellule infectée

66 Lymphocytes Tc Récepteur cellulaire – RCT – Reconnaissance du non-soi présenté par CMHI – Un lymphocyte Tc possède un RCT capable de reconnaître un épitope associé au CMHI Tc naïfs doivent être armés – Deux signaux sont requis : Reconnaissance par un RCT dun épitope spécifique associé au CMHI Cytokines activatrices produites par TH1 66 RCT Tc CD8

67 Réponse à Médiation Cellulaire Habituellement initié par cellules dendritiques – Associées aux tissus connexes aux surfaces externes Poumons, peau, tractus gastro- intestinal, etc. – Possède des récepteurs qui permettent linfection par la majorité des virus – Expriment CMHI( ) et CMHII( ) – Font la présentation dantigènes exogènes et endogènes 67

68 Réponse à Médiation Cellulaire 68 Infection Présentation dépitopes endogènes sur CMHI Phagocytose Présentation dépitopes exogènes sur CMHII T A CD 4 Reconnaissance par RCT de TH1 - activation T A CD 4 Tc CD8 Tc CD8 Reconnaissance par RCT de Tc - armement Tc CD8 Tc CD8 Tc CD8 Tc CD8 Tc CD8 Tc CD8 Amplification clonale de Tc armée

69 Attaque par les Cellules TC Armées 69

70 Survol des Réponses Immunes Acquises 70 Antigène Phagocytose par CPA Présentation dépitopes Activation de cellule T auxiliaire Cellule T auxiliaire activée Endocytose par cellule B Plasmocytes Anticorps Infection cellulaire Cellule T cytotoxique Cellule T cytotoxique activée Tuer Réponse humorale Réponse cellulaire

71 Interaction des Systèmes Innée et Acquis 71 Immunité Innée Barrières PhysiquesBarrières ChimiquesCellules Granulocytes Monocytes et Macrophages Cellules NK Anticorps Lymphocytes BLymphocytes T Immunité Acquise Cytokines


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