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La cristallographie en biologie structurale R. Fourme Univ. Paris-Sud et SOLEIL tel. 0608258675.

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1 La cristallographie en biologie structurale R. Fourme Univ. Paris-Sud et SOLEIL tel

2 1

3 Cristallisation Réservoir de solution avec proportion accrue de précipitant Goutte de solution saturée de protéine Méthode de cristallisation dite de la goutte pendante

4 Des cristaux aux propriétés très remarquables Des cristaux biphasiques mi-solides, mi-liquides (de 30 à 80% de liquide). Larrangement du cristal est du à lempilement des molécules, les parties vides étant comblées par la solution. Assez rigides pour présenter un ordre à très grande distance. La perfection de larrangement est attestée par la grande finesse des profils de diffraction, qui peut parfois atteindre quelques millièmes de degré. Assez plastiques pour supporter des réarrangements importants (déshydratation, amélioration de la qualité cristalline par recuit thermique, compression > 10% sous haute pression….) Peuvent être trempés à basse température (éventuellement en ajoutant de lantigel à la solution ) mais ne supportent pas un refroidissement lent au-dessous de 0° (la glace doit rester amorphe, et non cristalliser).

5 Montage dun cristal dans une mini-boucle de nylon. Cet échantillon est trempé dans de lazote liquide puis conservé dans un jet de gaz froid pendant lenregistrement des données pour diminuer les dommages secondaires sous irradiation X.

6 Les cristaux biologiques supportent bien une compression hydrostatique. La cristallographie sous haute pression (HPMX) est une méthode mature. Les enregistrements sont effectués sur les lignes de lumière CRISTAL (SOLEIL), ID27 et ID09 (ESRF). Coupe dune cellule haute-pression à diamants de grande ouverture, avec génération de force pneumatique. Dimensions du cylindre : 59 mm x 30 mm

7 12 3 Fragment de diamant utilisé pour combattre lorientation préférentielle du cristal par rapport aux culots des diamants Cristal frais de la protéine urate oxydase comprimé dans la cellule à diamants. Diamètre de la cavité dans le joint 350 m Cristal de la protéine lysozyme après irradiations successives et translations. La gamme utile de pression est limitée par la pression de dénaturation de la macromolécule, 0,1-2 GPa (1000 à atmosphères).

8 La diffraction X cristal RX diffraction = T.F. -1 Le calcul par TF -1 de la densité électronique en chaque point (x,y,z) donne une « image » du cristal. équivalence x z y I ~ F 2 hkl (x,y,z) = F e -2i (hx+ky+lz) hkl h kl 1 V Coefficients = facteurs de structure = nombres complexes. (modules |F| connus à partir des intensités, mais les phases restent inconnues) C'est le problème des phases ! |F| I hkl |F| i r 2 reconstruction

9 F hkl = f i e 2i (hx i +ky i +lz i ) 1 n n atomes en {x i, y i, z i } : La densité est calculable si la position des atomes est connue (donc si … le problème est résolu) |F| Facteur de diffusion du i ème atome Tous les atomes interviennent pour établir la densité électronique en chaque point de l'espace et vice-versa. Technique globale F = facteur de structure (nb. c omplexe ) = contribution des atomes à la diffraction 3 Un facteur de structure F hkl est la somme des contributions de tous les atomes

10 Variation du facteur de diffusion atomique f de quelques atomes avec langle de Bragg (unité: nombre délectrons). f est la TF de la densité électronique de latome à symétrie sphérique. Pour un angle de Bragg nul, f = Z. f diminue rapidement aux grands angles, car lextension du diffuseur (cortège électronique) nest pas négligeable devant la longueur donde du rayonnement comme dans le cas des neutrons. Cette diminution est encore plus rapide si la densité est étalée par du désordre statique ou dynamique.

11 Atome "ponctuel" ( à 0 K), B =0 f = f o e -Bsin 2 B = facteur d'agitation thermique (unité : Å 2 ) (ou facteur de Debye-Waller) f o = facteur de diffusion Atome très peu agité (B~5Å 2 ) Atome peu agité (B~10Å 2 ) Atome assez agité (B>15Å 2 ) 1010 Équivalence entre angle de Bragg et résolution pour = 1 Å. d (Å) basse moyenne haute (rare pour les macromolécules) f ~ I ~ Z 2 U diffracte 8500 fois plus que H 2,8 Å 1 Å 1,5 Å 5,7 Å 17 facteur d'atténuation dû à lagitation thermique (et au désordre).

12 Paires de Friedel et réflexions équivalentes par symétrie Pour la diffusion « normale », les deux membres dune paire de Friedel ont la même intensité I(hkl) = I(-h –k -l), les intensités des réflexions équivalentes par symétrie sont également identiques. Ex: pour une maille orthorhombique I(hkl) = I(-h k l) = I(h –k l) = I(h k –l) = I(-h -k l)… r i A h,k,l B h,k,l B -h,-k,-l h,k,l h,k,l = - -h,-k,-l |F h,k,l | = |F -h,-k,-l | 11 F h,k,l F -h,-k,-l

13 Notion de résolution Relation de Bragg: 2d sin = Les réflexions de Bragg aux « grands angles » (de Bragg), donc associées à des distances interréticulaires d petites, véhiculent linformation à haute résolution. Ces réflexions sont de faible intensité compte tenu du déclin des facteurs de diffusion aux grands angles, aggravé par de gros (10-60 Å 2 ) facteurs de Debye-Waller. En cristallographie des macromolécules, la valeur moyenne des intensités est faible (la diffusion se partage entre un très grand nombre de réflexions) et le désordre statique et dynamique est important. Lart du cristallographe est daméliorer le signal sur bruit: détecteur sans bruit propre, taches de Bragg petites (faisceau X parallèle et monochromatique, bon cristal), combattre la dégradation du cristal. Le RS est essentiel. On appelle résolution utile du diagramme de diffraction la valeur minimale d min de d pour laquelle le signal de diffraction est supérieur au bruit. d min correspond sensiblement à la distance minimale pour laquelle deux points de la structure sont vus séparément. La résolution «atomique» (rare) est obtenue pour d min < 1,3 Å. La meilleure résolution jamais atteinte est autour de 0,5 Å.

14 Application et visualisation des densités électroniques (x,y,z) = |F | e -2i (hx+ky+lz)+ hkl hkl hk l 1 V x y z=n z=n+1 etc... En 2D : 24

15 Structure de la pénicilline (sel de K+) Dorothy Hodgkin-Crawfoot, 1949 x yz En 3D : 25

16 Autre présentation en 3D ("TURBO", "O"…) 26

17 (x,y,z) = |F| e -2i (hx+ky+lz) + h kl hkl hk l 1 V FONCTION de PATTERSON Modules connus à partir des intensités Phase inconnue I hkl |F| hkl 2 I hkl = F hkl F* hkl I hkl = f i e 2i (hx i +ky i +lz i ) f j e -2i (hx j +ky j +lz j ) i=1 i=n j=1 j=n I hkl = f i f j e 2i [ h(x i -x j ) + k(y i -y j ) +l(z i - z j ) ] i j Vecteur différence entre les deux atomes i et j facteurs de diffusion de la paire i-j Le facteur de structure F est la somme des contributions des positions atomiques L'intensité I (ou F 2 ) est la somme des contributions des différences des positions atomiques (vecteurs différences) pondérées par le produit des facteurs de diffusion de la paire i-j. Fourier : 20 Noté : {|F|, }

18 Autres propriétés : Analogue à une densité mais les pics correspondent à des vecteurs-différences entre atomes. (n atomes n(n+1) pics Intensité des pics ~ Z 2. Beaucoup plus compliquée ! FONCTION de PATTERSON Si (x,y,z), calculée avec F, dépend de la position des atomes, la même fonction, calculée avec F 2 dépendra des différences entre atomes. On l'appelle P(u,v,w) Si (x,y,z) dépend d'une origine qui doit être connue ( vecteurs 0 -> atomes), P(u,v,w) ne dépend plus que des vecteurs-différence {u,v,w}, donc pas de l'origine. Ce Fourier (noté {|F| 2,0} ) est appelé Patterson P(u,v,w) = |F| 2 e -2i (hu+kv+lw) hkl hk l 1 V P(u,v,w) calculable en tout point à partir de lexpérience. P(u,v,w) a la même périodicité que (x,y,z) Élargissement des pics recouvrements importants. Pic à l'origine = somme des distances entre atomes identiques (coord. zéro). Symétrie du Patterson = celle du groupe de Laue (P2/m pour monoclinique, etc..). Donc centro-symétrique. Symétrie initiale : les différences entre positions symétriques entraîneront des positions spéciales : sections de Harker. 21

19 Autres types de Patterson's Patterson différence Patterson anomal Patterson ponctualisé P(u,v,w) = coef 2 e -2i (hu+kv+lw) hkl hk l 1 V Coef 2 =(|F o |-|F c |) 2 Coef 2 =F 2 point F point = facteur de structure ponctualisé F point =F réel. Pour les protéines : Coef 2 =(|F derivé |-|F native |) 2 F 0 e - Bsin 2 / 2 Suppression du pic à l'origine si coef 2 = (F 2 point - f i 2 ) Coef 2 = F± 2 28

20 Des détecteurs à localisation de surface haut de gamme

21 Détecteur MARResearch à plaque photosensible («imaging plate»). Diamètre utile 345 mm. La lecture est faite par mesure de la luminescence excitée par laser, avec un balayage en spirale assurant un temps de mesure constant par point. (principe: le faisceau laser se déplace radialement à vitesse constante; la vitesse angulaire de la plaque varie continûment avec = k/r. La plaque tourne donc de plus en plus vite à mesure que le faisceau laser se rapproche du centre). Temps de lecture: environ 60 sec (pour le diamètre maximal et des pixels de 140 m). Pixels de 100 m possibles.

22 Détecteur ADSC avec matrice de 9 grands CCD. Surface active : carré de 315 mm de côté. Conversion photons X-visible par phosphore. Chaque CCD est couplé à lécran par fibres optiques assurant une démagnification de limage. Temps de lecture de lordre de la seconde. Utilisé sur la ligne de lumière PROXIMA I de SOLEIL

23 Détecteur MARResearch à conversion directe photons X-électrons dans une couche mince de sélénium. Dimensions 420 x 320mm. Les charges sont détectées sur une surface pixelisée. Temps de lecture de lordre de la seconde. Efficacité de détection correcte dans un domaine de longueurs donde étendu, notamment à courte longueur donde.

24 Pilatus 6M de DECTRIS. Compteur de photons X à pixels hybrides.

25 Number of modules 5 x 12 = 60 Sensor Reverse-biased silicon diode array Sensor thickness 320 µm Pixel size 172 x 172 µm 2 Format 2463 x 2527 = 6,224,001 pixels Area 431 x 448 mm2 Intermodule gap x: 7 pixels, y: 17 pixels, 8.4% of total area Dynamic range 20 bits (1:1,048,576) Count rate per pixel > 2 x 10 6 photons/s Energy range 3 – 30 keV Calculated DQE3 keV: 80%; 8 keV: 99%; 15 keV: 55% Energy resolution 500 eV Adjust. threshold range 2 – 20 keV Threshold dispersion 50 eV Readout time 3.6 ms Framing rate 12 Hz Point-spread function 1 pixel Data formats Raw data, TIF, EDF, CBF External trigger/gate 5V TTL, 3 different modes Software interface Through socket connection; clients for EPICS, SPEC and stand-alone operation are available Cooling Close-circuit cooling unit for temperature stabilization Power consumption 350 W Dimensions (WHD) Approx. 600 x 600 x 550 mm Weight Approx. 95 kg Caractéristiques du Pilatus 6M

26 Image obtenue avec le détecteur à CCD. La gradation des couleurs (+ chaud = + intense) image la gradation des intensités.

27 De lintensité I hkl au module du facteur de structure F hkl - Dépendance angulaire 2 I IoIo - Polarisation - Correction de Lorentz |F| = c I L p Facteur déchelle Facteur de Lorentz Polarisation Intensité Polarisation P IoIo I 1+cos 2 2 p = 2 34

28 35 Correction de Lorentz L Les réflexions ne traversent pas toutes la sphère dEwald à la même vitesse Sens de rotation I1I1 I ~ aire S Géométrie de rotation : correction L ~ 1/sin pour que S 1 = S 2 Pour deux « équivalentes » : S 1 >> S 2 I2I2 Moyenne : n (Si n équivalentes pour I hkl ) I hkl = hkl I = 1 I = n Une sphère dEwald non-idéale a une certaine « épaisseur » directe tangente S1S1 S2S2

29 36 Facteur déchelle c Comparaison de jeux de données F hkl de : Cristaux différents Enregistrements à différentes I abs = f i 2 Pour une maille qui contient n atomes, lintensité totale théorique (absolue) est : I = 1 I = n (f = facteur de diffusion de latome) I abs = f io e -2B(sin )/ I = 1 I = n 2 2 Approximation : B ~ le même pour tous 2 I = 1 I = n I abs = e -2B(sin )/. f io I réel = c I abs I = 1 I = n I réel = c e -2B(sin )/ f io I = 1 I = n I réel f io = c e -2B(sin )/ ln ( ) = ln c -2B(sin )/ I = 1 I = n I réel 2 f io 2 2 = équation dune droite (droite de Wilson)

30 37 Droite de Wilson Facteur déchelle c o o o o o o o o o o o o o o o Pente = -2B ln c (sin )/ 2 2 ln ( ) I = 1 I = n I réel 2 f io I réel : moyennes des I hkl par tranche de résolution c = facteur déchelle global B = facteur dagitation thermique global

31 Importance des phases dans le calcul de la densité Analogie en lumière visible (conte du canard et du chat) Réalisation dune expérience de diffraction optique : masque Laser fentes écran Interférences Masque = « cristal fictif » « molécule » « cristal » 4

32 Importance des phases dans le calcul de la densité FT FT -1..Un canard basse résolution FT -1 FT FT -1 Un canard... Sa transformée de Fourier.. Un chat.. Sa transformée de Fourier Échelle dintensités

33 Variantes autour des données de diffraction Si on « coupe » en résolution : On voit un canard flou (mal résolu) Si on nutilise que la haute résolution : on voit seulement les bords du canard

34 FT -1 Kevin Cowtan's book of Fourier : FT -1 Amplitudes Phases Les termes les plus important dans la transformée de Fourier sont les phases (inconnues) et non les amplitudes (connues) ! Importance des phases dans le calcul de la densité calculer un canardchat ou un chatcanard ? Cartes composites ?? 6

35 Si on omet une région (secteur) des données, la reconstruction perpendiculaire sera déformée : Si on supprime des petites (10 %) zones aléatoirement distribuées : on retrouve une image « correcte » mais avec du bruit

36 Résolution de la structure cristalline : Approches expérimentales

37 De la diffraction à la carte de densité électronique Données de diffractionCarte de densité électronique

38 Résolution de la structure : détermination de la phase

39 Remplacement moléculaire Structure 3D connue maille Il faut placer au mieux la modèle dans la maille. La connaissance dun fragment de la structure peut suffire à amorcer le phasage. Programme AMORE de J. Navaza

40 Principe du phasage de novo Chaque facteur de structure F hkl est une somme dondes planes. En traduction vectorielle, cest un nombre complexe somme de nombres complexes. On détermine successivement la phase de chacun des F hkl. On travaille donc réflexion par réflexion. Supposons que la structure totale puisse se décomposer en deux sous-ensembles: - La structure principale, complexe et inconnue, constituée datomes de Z petits (C, N, O, H…) ou moyens (S) - Une structure relativement simple (dite structure de référence) constituée datomes qui diffusent dune manière remarquable : - soit des atomes lourds (à Z élevé) - soit des atomes lourds ou mi-lourds en situation de diffusion anomale La contribution de la diffusion de la structure de référence à chaque F hkl est calculable (module et phase) car la position de tous ses atomes est connue (la structure a été «résolue» au préalable). Cette onde peut donc être utilisée comme onde de référence. Lexpérience ne permet de mesurer que les amplitudes des ondes. Il faut donc transformer linformation sur les amplitudes en information sur les phases. Il faut en général faire trois mesures dintensités pour déterminer une phase sans ambiguïté. On fait en effet une triangulation. Problèmes à résoudre dans lordre: - Fabriquer la structure de référence - Déterminer les coordonnées de ses atomes -Déterminer la phase de la structure complexe en sappuyant sur la (ou les) structure(s) de référence.

41 Interférence constructive Comment résoudre en principe les phases de novo Hg protéine Interférence constructive L'onde de référence vient d'un ou plusieurs atomes diffusant de manière remarquable (atome lourd ou diffuseur anomal) placés à des positions connues dans le cristal. Ainsi, une information (inconnue) de phase a été transférée en amplitude (donc mesurable) Principe : utiliser comme pivot une structure de référence qui émet un contribution calculable à chaque facteur de structure I I 39 Interférence destructive

42 Diffusion anomale à différentes longueurs donde Remplacement isomorphe dérivéenative λ1λ1 λ2λ2

43 Méthode MIR La méthode MIR pure et dure exige trois mesures de lintensité du facteur de structure F hkl Une mesure venant du cristal natif Une mesure venant dun cristal dérivé I Une mesure venant dun cristal dérivé II Avec deux mesures seulement, il y a 2 solutions pour la phase de la structure principale Lambiguïté est levée par la 3ème mesure Avantages A ouvert la cristallographie des protéines (Max Perutz, Hb) Forts signaux, applicable à de très grosses structures. Difficultés: Fabriquer plusieurs dérivés Les mesures ne sont pas effectuées sur le même cristal Perte de temps et cause derreurs. Et surtout, les structures dérivées doivent être strictement identiques à la structure native (aux atomes lourds près). Ceci nest que rarement réalisé Phases imprécises. La structure principale et les sous-structures ne sont pas complètement séparables (cest à dire F h1, F h2 … tirés des mesures sont approximatifs) ne structure de référence qui émet un contribution calculable à chaque facteur de structure

44 La référence des phases condition d'isomorphisme : (X h,Y h,Z h ) Phases h F ph FpFp FhFh F ph = F p + F h L'atome lourd ne doit pas perturber le réseau cristallin |F h | connu (approximativment) à partir de la variation I ph - I p F h(hkl) = f h e 2i (hX h + kY h + l Z h ) h 41 Atome lourd :

45 Pt, Hg, U, Sm, Yb, Pb, Au,… sous forme de sel fabrication de dérivés datomes lourds Protéine + liqueur-mère + sel datome lourd Par trempage de cristaux natifsPar co-cristallisation Remplacement isomorphe Acétate d'uranyleUO Fluoro-uranate de potassium UO 2 F Sodium hexachloroplatinatePt(Cl) Chlorure de mercure Hg Triméthyl acétate de plomb Pb(CH 3 ) Chlorure de plomb Pb XénonXe54

46 M. Schiltz et al. (1994) J. Appl. Cryst. 27, 950 crystal Quartz capillary Xenon input bar

47 First structure solved using xenon binding under pressure 2 Xe sites with 100% occupancy LURE W32 beamline W. Bourguet, M. Ruff, P. Chambon, H. Gronemeyer & D. Moras (1995), Nature 375, 377 Ligand binding domain of the human nuclear receptor RXR

48 Pour une sous-structure simple, calculer la Patterson- différence {||F ph |-|F p || 2,0} pour localiser les atomes lourds Site principal Site secondaire 42

49 |F p | |F ph | FhFh o o' A A' Un seul dérivé = 2 phases valident la relation: F ph = F p + F h |Fph| 1 = module du dérivé 1|Fp| = module de la native Pour chaque hkl : Plan complexe réel imaginaire Comment déterminer les phases de la protéine ? = construction de Harker Fh = facteur de structure d'un atome lourd-1 1 Deux dérivés Une seule phase ! A FhFh Fh = facteur de structure d'un atome lourd-2 |Fph| 2 = module du dérivé 2 |F ph | 2 o 44 p

50 Autres "densités » utiles pour améliorer la structure. Fo - Fc 2Fo - Fc Visualisation des densités résiduelles - Recherche des atomes dhydrogène - Mise en évidence des défauts Valable si calc réel « Omit" maps (x,y,z)= ||F calc |-|F obs || e -2i (hx+ky+lz)+ calc hkl hkl hk l 1 V avec phases : calc hkl On "enlève" la contribution d'une partie douteuse de la molécule dans le calcul des F calc. Une carte (Fo-Fc) ne montrera que la partie soustraite, sans biais du modèle initial Pour amélioration des détails

51 Choix d une origine commune (Fouriers croisés { F i, j } ) Organigramme / Étapes : (h, k, l, F) p (h, k, l, F) h1 (h, k, l, F) h 2 Mise à léchelle Patterson différence { F 2, } Localisation atome(s) lourds principaux Fourier-différence { F, h } Pics résiduels ? {|F h |, h } Oui, (sites secondaires) inclusion dans la sous-structure (x,y,z,B,Occup) Affinement x i, y i,z i, B i, occup i non... Sous-structure d atomes lourds déterminée, donc F h i SCALA FFT MOSFLM, DENZO SCALEIT, TRUNCATE... VECSUM, RSPS, PEAKMAX MLPHARE, FHLE FFT SHARP, MLPHARE (Détection des sites minoritaires) 53 FFT

52 (suite..) Organigramme / Étapes : Sous-structure datomes lourds Calcul des F h Construction de Harker Détermination des phases probables Modification de densité (aplatissement de solvant..) Calcul de Fourier (carte de densité) départ best Fourier inverse, calcul des F best Fourier final, construction du modèle FFT SHARP, PHASE, MLPHARE, …. DM, SOLOMON FFT, O, TURBO-FRODO 54 |F| obs

53 Amélioration des phases : Modification de densité Une "bonne" carte de densité doit avoir une région de solvant « plate » Rarement le cas car les phases exp sont imprécises On impose donc une densité = 0 dans la région du solvant Méthode : 1) On calcule un masque M (x,y,z) pour lequel : Densité = 0 dans la zone solvant Densité = 1 dans la zone protéine 2) On modifie la densité expérimentale selon : corr (x,y,z) = initiale (x, y, z) x M(x, y, z) 3) On inverse (FT -1 ) pour obtenir les F corr (hkl) 4) On recalcule une carte avec |F| obs et corr 55

54 Amélioration des phases : Modification de densité En principe : meilleure carte, mais attention à bien définir la "frontière" protéine/solvant Résultat : Tiré de : 56 Carte initiale :

55 Méthodes de phasage de novo utilisant la diffusion anomale

56 Dépendance de f selon f (et ) ~ 3... mais la décroissance régulière de f et subit des variations brutales au passage dun seuil dabsorption (cm -1 ) 18 Pouvoir de diffusion et dabsorption dun atome

57 Si est proche dune transition électronique, le facteur de diffusion f de latome concerné est modifié et devient un nombre complexe, ce qui traduit des changements de lamplitude et de la phase de londe diffusée. Ces changements sont dépendants de f f = f° + f + if partie constante (indép. de ) corrections réelle et imaginaire Ex: variation de f et f pour Se au voisinage de son seuil dabsorption K 58

58 Conséquence sur les facteurs de structure : La loi de Friedel.....n'est plus exacte : F hkl F hkl sans diffuseur anomal : avec diffuseur anomal : hkl f f |F| = |F| hkl hkl |F| hkl hkl f± hkl =|F( )| hkl - |F( )| hkl f hkl = différences anomale F+ F- 61 f protéine at. lourd total f (+ /2) f FaFa FaFa

59 Une sous-structure constituée de diffuseurs anomaux permet donc dobtenir léquivalent de dérivés lourds. Mais tout se passe à lintérieur du même cristal. La structure ne change pas, cest londe diffusée qui est modulée par changement de la longueur donde. Lisomorphisme est parfait et un cristal est suffisant (sil résiste au rayonnement X). Mesurer lamplitude de F hkl à 3 longueurs donde permet la détermination non ambiguë de la phase pour la structure principale. En fait, deux mesures suffisent à cause de la violation de la loi de Friedel (paire de Fridel) et de la séparation des réflexions équivalentes en deux classes (paires de Bijvoët). Dans la méthode MAD, on sépare sans approximation la sous-structure de la structure principale. En effet on obtient une liste des coefficients F h qui permet de résoudre la sous-structure par méthode directe de phasage. Cette sous-structure peut posséder jusquà une bonne centaine datomes, la complexité dune « petite » molécule.

60 T pour Total bleu = dépendant A pour Anomal noir = indépendant |G T (±h, )| 2 = |F T (h)| 2 + a( ) |F A (h)| 2 + b( ) |F T (h)| |F A (h)| cos ( T - A ) ± c( ) |F T (h)| |F A (h)| sin ( T - A ) Le problème des phase a une solution analytique ! Conclusion : Les termes dépendant & indépendant de la long. donde peuvent être séparés (Karle, Hendrickson): sous forme d'une fonction : G T ( ) = F T ( h ) + D A ( ) |G T (±h, )| 2 = p 1 + a( )p 2 + b( )p 3 + c( )p 4 ( h : vecteur hkl ) 62

61 |G T (±h, )| 2 = p 1 + a( ) p 2 + b( ) p 3 + c( ) p 4 avec : p 1 = |F T (h)| 2 p 2 = |F A (h)| 2 p 3 = |F T (h)| |F A (h)| cos ( T - A ) p 4 = |F T (h)| |F A (h)| sin ( T - A ) inconnus (Contrainte additionnelle : p 1 p 2 = p p 4 2 ) Et aussi : a( ) = b( ) = 2 c( ) = 2 f° 2 f 2 ( )+ f 2 ( ) f° f ( ) déterminés à 3 long. d'onde différentes Ceci est un jeu de 4 équations linéaires à 4 inconnues avec une contrainte. p 1 …p 4 peuvent être calculés, puis |F T |, |F A | et finalement. 63 f' et f" connus

62 Atomes possédant un signal anomal utilisable Domaine pratique des longueurs d'onde en diffraction X (Å) trop dabsorption diffraction faible seuils K ( 5e - ) seuils L III ( e - ) Sr Fe Co Ni Cu Zn Ga Ge As Se Br Kr Rb (0,7699 Å) (1,7433 Å )(1,2837 Å)(0,9795 Å) Lanthanides Sm... Lu (1.8460)..(1.3412) U (0.7223) Sm Tb Ho PtHg (1.0722) (1.0093) 60 MoK CuK seuils M ( e - ) limité à: U ( = 2,2-3,4 Å)

63 En résumé MIRMAD Trois enregistrements à longueur donde fixe 3 cristaux différents Deux ou trois enregistrements à des longueurs donde différentes Un seul cristal incluant un diffuseur anomal - les atomes lourds doivent être …lourds Ex : Pt, Hg, U - metallo-enzymes (Fe, Mn, Cu, Zn..) - protéines modifiées Se-Met, Se-Cys sources de RX: labos ou RS source de RX: accordable (RS) et très stable. 64

64 Autres méthodes de phasage (mixtes) SIR = Single Isomorphous Replacement SIRAS = SIR + Anomalous Scattering SAD = Single Anomalous Diffraction Etc.. 1 seul dérivé lourd (+ native). On accepte l'ambiguité de phase en prenant la valeur centroïde --> erreur importante 1 dérivé lourd (+ signal anomal) + native. L'ambiguité de phase est levée par le terme anomal. 1 cristal avec diffuseur anomal à 2 long. d'ondes ( = native + dérivé anomal). 65

65 Construction du modèle moléculaire Densité électronique à résolution non-atomique Pré-requis : - On part en général d'une chaîne poly-Ala construite sur un tracé-repère calculé automatiquement (Ex: option "bones" de O) - Si résolution 1,7 Å : séquence nécessaire - Utilisation de "contraintes" chimiques et structurales de la chaîne peptidique. Modèle moléculaire 67

66 Étapes d'une "reconstruction" Carte de densité initiale ( |F| obs, calc ) "Squelettonisation" de la densité -Modèle poly-alanine (chaîne des C ) -choix de la direction de chaîne Construction des chaînes latérales à partir de motifs-repères (Cys, Tyr, Trp..) + de résidus construits ? OuiNon Affinement de la structure Nouvelle densité 68

67 Affinement des structures obtenues But : Obtenir une structure aussi précise que possible, compatible avec les données de diffraction (résolution…) Critère : Minimisation d'un facteur d'accord observé/calculé -Au sens de Hamilton : R = -Au sens des moindres-carrés : R = inconvénient : seuls les |F| obs sont expérimentaux (pas les phases) ||F| calc -|F| obs | |F obs | ||F| calc -|F| obs | 2 |F obs | 2 … Sur l'ensemble des réflexions Méthode : affinement des différences (observées/calculées) Par moindres-carrés sur : - coordonnées - facteur de température

68 D = w r (F o i -F c i ) 2 F = p 1 x 1 + p 2 x 2 + ….. + p n x n La structure est décrite comme une fonction linéaire d'une série de n inconnues x i On possède m points de mesure (les modules |F o |) m équations à n inconnues (m > n) Poids (de l'observation) observé calculé Les valeurs exactes des paramètres pi sont ceux qui minimisent la quantité : On fait varier les paramètres de façon à ce que i=1 i=m w r (F oi -F ci ) 2 i=1 i=m FciFci pjpj =0 j = 1, 2, …, n Calcul des dérivées trop long, on approxime (série de Taylor) 73

69 La dégradation des cristaux par irradiation X: Origine Le dommage par irradiation est un problème majeur car il limite la résolution de limagerie du matériau biologique. Le dommage initial est dominé par labsorption photoélectrique: un photon X est absorbé avec éjection dun électron dune couche profonde. La lacune ainsi provoquée est comblée par un électron dune couche externe. Pour les atomes concernés (principalement C, N, O, S, P) lénergie de cette transition est transmise primairement à un autre électron externe, qui est éjecté comme un électron Auger. Ces électrons produisent des des cascades délectrons secondaires. Ces divers processus sont courts, à léchelle de quelques femtosecondes (fs). La perte délectrons et la formation de radicaux dans la protéine et leau produisent, avec une échelle de temps comparativement beaucoup plus longue, des changements électroniques et chimiques dans léchantillon.

70 Dommages par irradiation: les moyens dy rémédier Les principaux procédés permettant de combattre ces effets sont les suivants: Refroidir les échantillons à très basse température(<100K), ce qui ralentit la propagation des radicaux produits. Dans le cas de cristaux, il faut empêcher la formation de glace en procédant à une trempe et/ou en ajoutant un antigel. Utiliser des photons X de haute énergie: keV au lieu du canonique 12 keV). Cest un nouveau paradigme, mais qui nécessite un détecteur ayant une bonne efficacité à ces énergies. Lutilisation de composés chimiques piégeant les radicaux est généralement peu efficace. Une approche nouvelle consiste à utiliser un rayonnement constitué de pulses courts et extrêmement intenses produits par des lasers X à électrons libres (X-FEL) (par exemple le LCLS à Stanford, TESLA en construction à Hambourg). Dans ce cas, des diagrammes de diffraction avec une résolution limitée par la diffraction peuvent être enregistrés avant destruction de léchantillon. Cette méthode ouvre aussi la perspective de résoudre la structure de nanocristaux ou même de matériaux non cristallisés. Dans ces deux cas, lintensité diffractée est faible à cause de la réduction ou de la suppression de leffet amplificateur dun grand nombre dunités répétées. Lénorme intensité du pulse compense plus ou moins cette perte dintensité. Le problème des phases peut en principe être résolu par des méthodes de sur-échantillonnage avec des algorithmes itératifs. Ce domaine de recherches est en plein essor.

71 hémoglobine

72 Octanucléotide GGTATACC (modèle de la forme A de lADN). Structures précises (résolution 1,6 Å ) à P ambiante et 1.4 GPa (paire stéréo). Cette molécule est très compressible axialement et pratiquement pas transversalement. Cest un ressort moléculaire. La géométrie des paires Watson-Crick, qui portent linformation génétique, est quasi- invariante avec la pression. Importance possible de ces propriétés pour la sélection de molécules prébiotiques si conditions environnementales extrêmes.

73 Protéase de VIH avec un inhibiteur lié au site actif

74 Ribosome


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