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PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse1 Les biofilms bactériens P.L. TOUTAIN ECOLE NATIONALE VETERINAIRE T O U L O U S E Update mai 2013 Costerton, 1999,

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1 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse1 Les biofilms bactériens P.L. TOUTAIN ECOLE NATIONALE VETERINAIRE T O U L O U S E Update mai 2013 Costerton, 1999, Science, 284: Pour aller sur notre site si vous avez récupéré nos diapositives ailleurs

2 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse2 Définition dun biofilm Un biofilm est une communauté de microorganismes (bactéries, champignons etc.) adhérant entre eux, fixée à une surface ( bactéries dites sessiles), et caractérisée par la sécrétion d'une matrice adhésive et protectrice. Ils sont naturellement résistants aux antibiotiques Ils sont à lorigine de nombreuses infections chroniques

3 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse3 Les biofilms Le mode de vie en biofilm est l'une des deux modalités de vie des organismes unicellulaires ce serait le mode de vie naturel de la plupart des microorganismes, notamment en milieu hostile l'autre mode de vie est la flottaison libre de type dit « planctoniques » dans un milieu liquide. La structure et la physiologie du biofilm donne aux bactéries ce que lorganisation tissulaire apporte aux cellules des êtres supérieurs.

4 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse4 Les biofilms Ils peuvent se développer sur n'importe quel type de surface naturelle (débris cellulaires, séquestres) ou artificielle (prothèse, sonde, cathéter…) mais aussi sur des tissus vivants (endocardites) La matrice du biofilm, est constituée de polysaccharides (peptidoglycanes, cellulose) imbibée d'eau.

5 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse5 Les biofilms: adaptation phénotypiques et génotypiques Un aspects majeurs des biofilms est le changements dans les phénotypes correspondant au changement du mode de vie de «planctonique et individuel », à celui de « fixé et communautaire ». Des groupes de gènes (>10 3 ) changent leurs mécanismes d'activation pour assurer cette permutation de style de vie (en quelques minutes). L'environnement particulier du biofilm permet ( ou oblige ) les bactéries à coopérer ensemble ce qui nest pas le cas dans un environnement libre. Les bactéries vivant dans un biofilm ont des propriétés très différentes de celles des bactéries isolées de la même espèce.

6 6 Développement du « phénotype biofilm » Il résulte dune activation rapide de gènes (>10 3 gènes ) Surfaces biologiques Exploration Activation des gènes d adhésion (adhésine…) Quorum sensing Production de la matrice extracellulaire (> 12 minutes) Facteur sigma contrôlant la transcription

7 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse7 Biofilms et « le quorum sensing » Certains biofilms possèdent des canaux aqueux Ils assurent la distribution des nutriments et de celle de molécules de signalisation, établissant la communication entre cellules par des signaux biochimiques. La formation du biofilm est contrôlée par des signaux dits de cellule-à- cellule, et des mécanismes dits de quorum sensing, ou perception du quota, basés sur le principe de masse critique. Les systèmes de perception du quota chez les bactéries Gram-négatives détectent la densité des cellules en utilisant des signaux de cellule-à-cellule dépendant de la taille de la population, Quand ce signal atteint une certaine concentration critique, il active un régulateur transcriptionnel qui induit des gènes cibles spécifiques. La nature et donc la fonction des molécules signalant les échanges de cellule-à-cellule changent à partir d'une concentration donnée des bactéries.

8 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse8 Protection des bactéries dans un biofilm 1.Protection passive –La matrice protège physiquement les bactéries contre l'entrée des agents antimicrobiens, les détergents et les antibiotiques. 2.Protection métabolique. – les bactéries entourées de biofilm sont moins actives métaboliquement, donc moins réceptives aux agents antimicrobiens

9 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse9 Protection des bactéries dans un biofilm 3.Protection active –La résistance de P. aeruginosa aux antibiotiques a été attribuée à des pompes defflux du biofilm expulsant activement les composants antimicrobiens. 4.Protection génétique – lors de leur implantation dans un biofilm l'expression génétique des bactéries peut être est modifiée. Lenvironnement du biofilm est propice aux échanges de matériel génétique et permet le transfert de caractères de résistance.

10 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse10 Le cycle de vie dun biofilm Center for Biofilm engineering, Montana State University

11 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse11 Les biofims sont la cause dinfections chroniques

12 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse12 Biofilm: une cause dinfection chronique JW Costerton (1999) Science, 284: Les bactéries planctoniques peuvent être éliminées par les mécanismes de défense naturels (anticorps, phagocytes…) et elles sont sensibles aux antibiotiques Antibiotic AntibodyPlanktonic cell Biofilm cell Phagocyte enzymes

13 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse13 Biofilm:une cause dinfection chronique JW Costerton (1999) Science, 284: Les bactéries peuvent adhérer entre elles pour former un biofilm notamment sur une surface inerte; cette communauté, sessile, est résistante aux anticorps, aux phagocytes et aux antibiotiques Antibiotic AntibodyPlanktonic cell Biofilm cell Phagocyte enzymes

14 14 Biofilm: une cause dinfection chronique JW Costerton (1999) Science, 284: Les phagocytes sont attirés par les biofilms. La phagocytose est inopérante mais les enzymes phagocytaires sont libérées localement Antibiotic AntibodyPlanktonic cell Biofilm cell Phagocyte enzymes

15 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse15 Biofilm: a cause of persistent infection JW Costerton (1999) Science, 284: Les enzymes phagocytaires vont endommager les tissus autour du biofilm et des bactéries planctoniques vont essaimer du biofilm Cette libération peut être la cause dune dissémination de linfection et dune infection aiguë dans un tissu voisin Antibiotic AntibodyPlanktonic cell Biofilm cell Phagocyte enzymes

16 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse16 Biofilm biology Sessile bacteria cell releases antigens and stimulates the production of antibodies but the antibodies are not effective in killing bacteria within biofilm but may cause immune complex damage to surrounding tissues rarely resolved by the host defense mechanism

17 In vivo, les biofilms se présentent sous la forme dagrégats de dimension limitées (5-200µm) et non de films Ce nest quen cas de corps étrangers (cathéter…) que le biofilm pourra se développer comme dans les situations in vitro 17

18 Biofilm: action dun antibiotique A gauche, developpement dun biofilm (plaque verte); à droite action de la tobramycine (100µg/mL pendant 24h) qui tue les bactéries périphériques (zone jaune) mais natteint pas les bactéries centrales (points verts) 18

19 Biofilms: une revue récente sur leur biologie Trens in microbiology19

20 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse20 Biofilm bactérien & risque infectieux Les infections « classiques » sont dues à des bactéries planctoniques contre lesquelles les antibiotiques sont actifs

21 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse21 Biofilm bactérien & risque infectieux De plus en plus dinfections, notamment chez les sujets débilités, sont dues à des bactéries commensales du corps ou de lenvironnement – ces bactéries forment des biofilms

22 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse22 Biofilm bactérien & risque infectieux Un grand nombre d infections sont dues à des bactéries commensales du corps de lanimal ou de son environnement: Peau: Staphylococcus aureus, S. epidermidis Muqueuses:Streptococcus suis et S. agalactiae, Voies respiratoires: Pasteurella multocida, P. haemolytica, Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma spp. ou Haemophilus parasuis, Bactéries de leau: Pseudomonas aeruginosa

23 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse23 Biofilms et risques infectieux Quand les bactéries colonisent des tissus, elles utilisent des mécanismes d'adhésion pour éviter dêtre éliminées par le flux des sécrétions biologiques (ascenseur du mucus bronchiques, sécrétion vaginale etc. ) ou encore par les flux physiologiques comme celui du tube digestif, du lait etc.

24 24 Infections associées à des biofilms 1.Infections ou maladies caries dentaires Otite moyenne Ostéomyélites Prostatites 2.infections nosocomiales Sutures lentilles de contact cystite associée à une sonde urinaire Sonde endotrachéale Cathéter central veineux Prothèse orthopédiques Costerton (1999) Science, 284:

25 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse25 Ostéomyélite & biofilm à gauche une broche a été mise 3 mois avant cette radio et on notera le développement dune ostéomyélite avec la présence dun gros séquestre; a droite, 2 ans plus tard après un traitement chirurgical de la fracture, mise dune plaque et et une stérilisation de la zone

26 26 infections associées à des biofilms Mammite à Staphylococcus aureus Phénotype planctonique Phénotype en biofilm Expression des facteurs de virulence Expression des gènes de sessilité

27 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse27 La plaque dentaire est un biofilm

28 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse28 Infection du pâturon donnant un biofilm

29 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse29 Biofilm: aspects thérapeutiques

30 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse30 Biofilm: aspects thérapeutiques Les antibiotiques ont une actions symptomatiques sur les infections liées aux biofilms car ils détruisent uniquement les bactéries planctoniques qui essaiment de façon programmée mais ils ne peuvent pas éradiquer les bactéries du biofilm Le biofilm toujours présent est à lorigine de la récurrence des symptômes à larrêt du traitement –Recours à la solution chirurgicale quand elle est possibles (séquestres, ostéomyélite etc.)

31 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse31 Biofilm: le mécanisme des rechutes après traitement aux antibiotiques

32 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse32 Résistance vs. tolérance

33 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse33 Nouvelles approches thérapeutiques des biofilms

34 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse34 Biofilm: test de sensibilité Les pathogènes semblent normalement sensibles aux antibiotiques car les techniques conventionnelles ne testent que les bactéries planctoniques Nécessité dune évaluation appropriée de la sensibilité des bactéries –CMIB: CMI du biofilm ( BMIC= Biofilm Minimal Inhibitory Concentration), sensibilité des bactéries libérées par le biofilm. –CMEB : Concentration Minimale dEradication du Biofilm (MBEC= Minimal Biofilm Eradication Concentration,) Sensibilité des bactéries dans le biofilm

35 35 Évaluation de la sensibilité bactérienne pour les biofilms MBEC® Système à 96 puits pour tester des biofilms MBEC High- throughput Screening - (HTP) Assay

36 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse36

37 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse37 Différences entre les CMI & CMI-Biofilme pour la pénicilline µg/ml Melchior et al 2006

38 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse38 CMI, CMIB & CMEB pour différent antibiotiques vis-à- vis de différentes souches de Staphylococcus aureus Melchior et al ²2006

39 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse39 Sensibilité à la néomycine de différentes souches de St aureus planctoniques vs. en biofilm dans du Mueller Hinton ou du lait CMI CMIB (CMI du biofilm) CMEB (CM pour éradication du biofilm CMIB-lait CMEB-lait CM=concentration minimale Melchior et al 2006

40 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse40

41 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse41 Le cas des staph aureus internalisés ; il faut attendre le turnover naturel des PNN pour voir ressortir le germe et latteindre avec un antibiotique conventionnel


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