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SYNTHÈSE DE BRASSINOSTÉROIDES ET ÉTUDE DE LEUR EFFET NEUROPROTECTEUR Benoit Daoust, Martin Boisvert, Maria-Grazia Martinoli et Fanny Longpré D é partement.

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1 SYNTHÈSE DE BRASSINOSTÉROIDES ET ÉTUDE DE LEUR EFFET NEUROPROTECTEUR Benoit Daoust, Martin Boisvert, Maria-Grazia Martinoli et Fanny Longpré D é partement de Chimie-Biologie, Universit é du Qu é bec à Trois-Rivi è res.

2 Plan de la présentation Maladie de Parkinson Hypothèse de travail Brassinostéroïdes (BRs) Synthèse Résultats in vitro neuroprotection

3 Maladie de Parkinson personnes atteintes au Québec ( au Canada) Mort des neurones dopaminergiques (produisant la dopamine, un neurotransmetteur) dans la substantia nigra W. Dauer, S. Przedborski, Neuron, 2003, 39, 889.

4 Maladie de Parkinson Aucun traitement curatif disponible –Seulement traitement des symptômes (L-DOPA) mais après quelques années de traitement dyskinésie De + en + indices semblent démontrer que le stress oxydant jouerait un rôle dans la mort des cellules nerveuses Dopamine Dopa Décarboxylase L-dopa L.M. Sayre et al., Curr. Med. Chem., 2001, 8, 721. H. Ehsan et al,Plant J., 2005, 43(2), 251.

5 BRs et effet neuroprotecteur ?? BRs et neuroprotection = nil Étude sur la gourgane (H. Apaydin, S. Eratn, S. Ozekmekci, Movement Disorders, 15 (1), 2000) On fait manger de la gourgane (250g, 2 X / jour) à des patients atteints du Parkinson, car gourgane riche en L-dopa. Mais la [L-dopa] nexplique pas leffet ultrabénéfique chez les patients. BRs présents dans la gourgane ! Gourgane

6 Effet neuroprotecteur ?? M. Nunez, P. Mazzafera, L.M. Mazorra, W.J. Siquiera, M.A.T. Zullo, Biologia Plantarum 47(1), (2003/4) ; L.M. Mazorra, M. Nunez, M. Hechavarria, F.Coll, M.J. Sanchez-Blanco, Biologia Plantarum 45(4), (2002). Étude de leffet de BRs sur les enzymes antioxydantes de riz et de tomates.

7 Effet neuroprotecteur ?? Hypothèse de travail : Comme les BRs sont connus pour activer les enzymes anti-oxydantes de certaines plantes, Que leffet neuroprotecteur chez la gourgane (contient BRs) nest pas seulement dû à la L-DOPA Il est possible que les BRs aient un effet neuroprotecteur sur le système nerveux.

8 Brassinostéroïdes phytostérols dans les plantes comestibles du Qc (betterave, carotte, maïs, radis, …) Découverts en 1979 (brassinolide) ; extrait de Brassica napus L. (colza) (4 mg à partir de 40 kg de pollen) phytohormones (croissance) si on traite les plantes avec BRs, leur développement augmente [BRs] dans les plantes : à %. BRs non toxique sur les mammifères (>5g/kg pour voir un effet sur souris ; Kutzmtiskii et al., Technical Report, 1991, Institute of Bioorganic Chem., Minsk (Belarus)) Colza A. Bajguz & A. Tretyn,Phytochem., 2003, 62(7),1027.

9 Brassinostéroïdes BRs caractérisés et isolés

10 Brassinostéroïdes synthèse totale ; non produit de départ : stigmastérol 13C* (11 contigus)

11 Synthèses Stigmastérol (10g = 277$) MsCl, Et 3 N. Toluène 0°C, 1h, atm de N 2 KHCO 3 Acétone/Eau 3:1 reflux 4h Jones 8N-CrO 3 Acétone 0°C, 10 min T.C.,McMorris et al, J. Chem. Soc.Perkin Trans. 1, 1996, 295 ; K. Mori et al.,Agric. Biol. Chem.,1987, 51(7), % 77% 72%

12 Synthèses py-HCl LiBr DMA Reflux 4,5h OsO 4, K 3 Fe(CN) 6, K 2 CO 3, Hydroquinidine 4-chlorobenzoate MeSO 2 NH 2, 36j Rdt = 41% K.B. Sharpless et al, J. Am.Chem.Soc.,1988, % ~ 1:1

13 Synthèses py-HCl LiBr DMA Reflux 4,5h OsO 4 NMO Acétone/Eau 9:1 12h, tp 92:8 en faveur du produit désiré 60% 68%

14 Synthèses i) AcOH, H 2 SO 4, H 2 O, reflux, 1h30 ii) DMAP, Ac 2 O, Pyridine, tp, 3h, KOH 5% dans MeOH, Tp, 1h30 Dihydroxylation (OsO4) 3-acétyl-28-Homotéastérone 70% 89%

15 Synthèses p-NO 2 C 6 H 4 COOH, DEAD, P(Ph) 3, THF, 0°C 15 min puis tp 10h NaOH, MeOH, tp, 1h, Dihydroxylation (OsO4) 28-Épihomotéastérone 65% (2 étapes)

16 Synthèses H 2, 1 atm, Pd/C 10%, EtOAc, 24 h 95%

17 BRs commerciaux 22S, 23S-28-Homobrassinolide naturel (pureté 96%!) non naturel (pureté >99%) 24-épibrassinolide

18 Neuroprotection Notre modèle in vitro : cellules PC12 différenciées en neurones dopaminergiques avec NGF Cellules PC12 non-différenciées Cellules PC12 différenciées (après traitement au NGF) L.A.Greene, A.S. Tischler, PNAS, 1976, 73(7), 2424.

19 Neuroprotection Notre modèle in vitro : cellules PC12 différenciées en neurones dopaminergiques avec NGF La neurodégénérescence cellulaire du Parkinson reproduite avec MPP+ MPP+ 1-Méthyl-4-PhénylPyridinium W. Dauer, S. Przedborski, Neuron, 2003, 39, 889.

20 Neuroprotection Dosage de la LDH par colorimétrie Cellules traitées avec MPP+ et nos molécules préparées Mortalité cellulaire évaluée par dosage de la LDH libérée par les cellules abîmées C. Korzeniewski, D.M. Callewaert, J. Immunological Methods, 1983, 64, 313.

21 Neuroprotection ANOVA, Student-Newman-Keuls ***p<0,001 vs Ctrl; ooo p<0,001 vs MPP+ (n=3). Épibrassinolide 22S, 23S-Homobrassinolide

22 Neuroprotection homocastastérone MB 57B

23 Neuroprotection 22,23-Dédihydroxy-28-homotéastérones

24 Neuroprotection MB 158 ( C=C absent)

25 Conclusion Synthèse de 5 BRs ou précurseurs Molécules préparées (en particulier homocastatérone) effet neuroprotecteur Les groupements OH en 22 et 23 ne contribue à lactivité neuroprotecteur que lorsque quils sont en. Stéréochimie du 3-OH des précurseurs de la 28- homotéastérone ninfluence pas leffet de neuroprotection de manière significative Le précurseur sans C=C en ne présente pas leffet de protection recherché à faible concentration (10 -9 M). Une alimentation riche en betteraves, carottes, … pourrait aider à prévenir le Parkinson dû à la présence de BRs ? On ne peut pas le dire encore !

26 Travaux futurs Poursuivre létude RSA (et aussi dihydroxylation !) Autres tests bio Effet antioxydant des BRs : SOD, catalase, glutathion peroxidase, dihydrorhodamine Effet anti-apoptotique des BRs : Tunel, Caspase 3, Bax/Bcl2, fragmentation ADN (elisa) Métabolisme des BRs

27 Travaux futurs BRs de structure ergostane 1. O 3 2. DMS BRs Nouvelle méthodologie ergostane Z. Li et al., Tet. Lett., 2003, 44, T.G. Back et al., Can. J. Chem., 1993, 71, 156. B.H. Hazra et al., Tetrahedron, 1994, 50(8), 2523.

28 Travaux futurs BRs de structure ergostane Nouvelle méthodologie ou sans AL, borolane de Roush Notre hypothèse de travail

29 Remerciements Martin Boisvert Fanny Longpré Maria-Grazia Martinoli Julie Carange Jennyfer Mercklé Pauline Dubromez

30 Questions ?

31 Sélection Mallyl (état de transition non-cyclique)

32 Sélection Mallyl (état de transition cyclique)

33 Brassinostéroïdes Squelettes des brassinostéroïdes cholestane

34 Brassinostéroïdes Squelettes des brassinostéroïdes ergostane

35 Brassinostéroïdes Squelettes des brassinostéroïdes stigmastane

36 Brassinostéroïdes Produits de départs ? Stigmastérol (R 1 =Et, R 2 =H) (10g = 277$) Crinostérol (R 1 =Me, R 2 =H) (pas commercial) Brassicastérol (R 1 =H, R 2 =Me) (5mg = 377$) Ergostérol (10g = 112$) Pregnénolone (25g = 120$)

37 Synthèses Signal « large » car J Hax-Hax (~ 180°) Signal « étroit » car les J ( 0 ou 180°) A A cycle A 4 ppm 6,7 Hz de largeur 43 ppm 22,9 Hz de largeur

38 Parkinson traitement au MPP+ MPTP 1-Méthyl-4-Phényl-1,2,3,4-TétrahydroPyridine MPP+ 1-Méthyl-4-PhénylPyridinium Passe la barrière hématoencéphalique MPDP+ MAO-B spontanée

39 Parkinson Les cellules gliales transforment le MPTP en MPP+ MPP+ entre dans les neurones dopaminergiques par le DAT Une fois dans le neurone, MPP+ (via différents mécanismes) augmente la production de ROS (reactive oxygen species) et diminue la synthèse de lATP, donc perte de neurones dopaminergiques MPTP 1-Méthyl-4-Phényl-1,2,3,4-TétrahydroPyridine MPP+ 1-Méthyl-4-PhénylPyridinium

40 Parkinson Dauer et Al, Neuron, 2003, 39,

41 Synthèses pTsNHNH2, PTSA MeOH/CH Cl3 Reflux, 4h30 (67%) NaBH4, EtOH Reflux, 8h (62%) Dihydroxylation ? Pas encore testé

42 Neuroprotection Effet du stigmastérol sur la toxicité du MPP+ dans les cellules PC12 neuronales.

43 Dihydroxylation Hydroquinidine 4-chlorobenzoate

44 Dihydroxylation

45

46 Activité antioxydante des BRs

47

48

49 Brassica vegetables

50 Test LDH Réactif

51 Mitsunobu

52

53 Osmylation

54


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