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Le 24 Novembre 2011 Cours de chromatographie d exclusion Professeur SAALAOUI Ennouamane.

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1 Le 24 Novembre 2011 Cours de chromatographie d exclusion Professeur SAALAOUI Ennouamane

2 CHROMATOGRAPHIE DEXCLUSION FILTRATION TAMISSAGE MOLECULAIRE Chromatographie dexclusion -diffusion Chromatographie par perm é ation de gel g é n é ralement Chromatographie d exclusion st é rique Chromatographie dexclusion – de taille Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

3 Chimie macromoléculaire Phase mobile est de nature organique Perm é ation de gel Filtration sur gel Biopolymères commeprotèines La phase mobile est aqueuse Chromato dexclusion de taille Silices greff é es et non des gels Cha î nes poly-2hydroxym é thyl aspartamide Bcp de NH 2, OH, CO caractère hydrophile Liaisons hydrog è nes cr é e des ponts des cha î nes polyaspartamide Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

4 Le principe de la chromatographie d exclusion -Le tamissage mol é culaire (pores) -S é paration en fonction de la taille -Le chemin parcouru par les mol é cules d é pend de leur taille -Les plus grandes s excluent -Les plus petites s inclusent Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

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6 liaison 1-6 et 1-4 dextrane (polym è res de glucose) des ponts 1959 Branchement + R é seau + ou - serr é S é phadex G10, G15, G200 Degr é de r é ticulation d é croissant Mailes + en+ grandes Le choix en fct de la taille des mol é cules à s é parer Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

7 V T = V o + V p + V s V o = V m V i = Vp V s = V G VPVP VPVP VSVS VPVP VSVS VSVS Vo Principe de lexclusion Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

8 Diff é rents volumes sur le chromatogramme Vo VRVR VT VoVo VpVp VsVs Vc V c = V o + V P + V S VT = Vo + V P Volume de la colonne VPVP VPVP VSVS VPVP VSVS VSVS Vo Vo = volume mort = Vm Vp = volume des pores Vs = volume interne Vg Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

9 V C = V o + V P + V S V T = V o + V P V R = V o + V P f. K. V S est n é gligeable V T = V c f = fraction des pores 1-0 Si K=1 mol é cules diffusent bien V R = Vo + V P f. Si f=0 mol é cules totalement exclues VR = Vo Si f=1 mol é cules incluses V R = V o + V P Volume de diffusion totale f=0 f=1 0 f 1 log PM VRVR VoVPVP Ou V e Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

10 Si K 1 ceci signifie V R V T forte inclusion D autres ph é nom è nes que l exclusion Adsorption ou É change ionique Cas des substance aromatiques avec les gels de dextarn V R = V o + V P f. K. Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

11 V R = V o + V P f. K. Si K= O Mol é cules compl è tement exclues K.f (Vo-VR(= Vp Kav = V R -V O Vp + VG Available accessible Kav = Vp Vp + VG V T = Vo + V P + V G VP + VG= VT - Vo = Kav Vo-VR VT – Vo Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

12 La s é lectivit é R é tention relative Distribut° des 2 S -porosit é du gel -taille des S -uniformit é des des pores Rs = ¼ ( -1)/. k 2 /(1+k 2 ). N 2 1/2 Efficacit é de la colonne Influence de la capacit é La r é solution f=0f 1f=1 12 La s é lectivit é R é tention relative Distribution 2 S -porosit é du gel -taille des S -uniformit é des des pores = T R2 – T o Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012 –

13 Exclusion Diffusion totale Inclusion log PM f=0 f=1 Domaine explor é k = K. Vs/V M Vs = f. V p En chromato d exclusion le K est tj voisin de 1 ; k entre 0,5 et 3 k = Vs/V M Vs volume des pores accessibles V M volume extragranulaire Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

14 R s = ¼ ( -1)/. k 2 /(1+k 2 ). N 2 1/2 Le R augmente en même temps que k Au del à de 5 à 10, la r é solution ne varie pas N = 16 (T R 2 VoVo VpVp VsVs H = L/N Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

15 Aspects pratiques Sur couche mince Sur couche mince colonne colonne Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

16 Caract é ristiques des Phase stat Le des pores (r é ticulation?) Le des pores (r é ticulation?) La taille et la forme des particules La taille et la forme des particules –Petites –Sphériques –Granulométrie variable Linertie Linertie Laffinité des gels pour les solutés Laffinité des gels pour les solutés La consistance La consistance micomiètre Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

17 Diff é rents supports diff é rents polym è res dextrane polyacrylamide agarose La phase stationnaire Substrat du gel (phase dispers é e) La phase dispersante le solvant Grains, bille ou perle calibr é es Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

18 Classification des gel dexclusion Xérogels : - mous - semi rigides Dextran ; agarose ; polyacrylamide - séphadex S S fractogel S ne gonflent pas Perles de verreOu silice poreuse Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012

19 Colonnes de dessalages de solutions prot é iques, prêtes à l'emploi, rapides et é conomiques. En 3-4 minutes, les sels et mol é cules de poids mol é culaire < 5 kDa sont é limin é s Caract é ristiques du gel Polym è re poreux hydrophile : r é duction au maximum des adsorptions non sp é cifiques Stabilit é m é canique é lev é e : r é sistance à des pressions jusqu à 7 bars Stable aux pH de 0 à 14 Pas de r é traction ni de dilatation des billes quel que soit le tampon des colonnes TSK-Gel de chromatographie d exclusion de tailles, aussi bien pour la GFC (Gel Filtration Chromatography) s é paration de peptides, prot é ines et autres mol é cules solubles en milieux aqueux que pour la GPC (Gel Perm é ation Chromatography) s é paration de polym è res solubles en milieux organiques. Professeur SAALAOUI Ennouamane2011/2012


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