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Analyse de liaison, dose-effet 2 sites différents, coopérativité positive?

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1 Analyse de liaison, dose-effet 2 sites différents, coopérativité positive?

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3 Of Cours 3 Slide 3 Courbes dose-effet, courbes de liaison

4 Of Cours 3 Slide 4

5 Of Cours 3 Slide 5 Calcul de la EC 50 et de la IC 50

6 Of Cours 3 Slide 6

7 Of Cours 3 Slide 7 Conclusion: La EC 50 dépend uniquement du dénominateur, qui décrit R tot La IC 50 dépend uniquement du dénominateur, qui décrit R tot Si on mesure dans les mêmes conditions dincubation la courbe de liaison et la courbe dose effet, EC 50 et IC 50 doivent être identiques.

8 Of Cours 3 Slide 8 Liaison ligand-récepteur : rappel Compétition: Saturation:

9 Of Cours 3 Slide 9 Liaison « coopérative »

10 Of Cours 3 Slide 10 Correspondance IC 50 -EC 50 absolue? Voir fichier « Excell »! (« Binding-Effet.xls »)

11 Structures des récepteurs et activation Une ou plusieurs conformations actives?

12 Of Cours 3 Slide 12 Familles de récepteurs Transmembranaires: oCanaux ioniques contrôlés par les ligands Signalisation très rapide, plusieurs Sous Unités(4-5),plusieurs TM (4-5 par sous unité) oG-protein coupled receptors Signalisation rapide (msec), 7 TM, vraisemblablement dimères oRécepteurs à activité enzymatique ou recrutant des enzymes 1TM dimères ou multimères Nucléaires et cytoplasmiques Protéines solubles, Homo- or hétéro-dimères

13 Of Cours 3 Slide 13 Canaux: Au moins 3 super families avec plusieurs hélices TM Vraisemblablement: 3 Sous Unités 4 Sous Unités 5 Sous Unités

14 Récepteurs canaux ioniques 2 (ou 3) états: Ouvert Fermé Désensibilisé

15 Of Cours 3 Slide 15 Récepteurs de lacetylcholine (nicotinique): Canal Na +, ouvert en réponse à la liaison d AcetylCholine 5 Sous-Unités, chacune 4 hélices TM

16 Of Cours 3 Slide 16 Liaison, effet biologique R AcCh R Glycine

17 Of Cours 3 Slide 17 Deux ou trois états? (α7-AcChR-L247T) (α7-AcChR-wt)

18 Of Cours 3 Slide 18 Effecteurs allostériques? Reconnaissent de préférence état ouvert et le stabilisent Reconnaissent de préférence état désensibilisé et augmentent louverture Effet sur la liaison dagoniste?

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20 Of Cours 3 Slide 20 Extracellular ring Central ring (selectivity filter) Intermediate ring Gate D E/Q S L Intracellular ring

21 Of Cours 3 Slide 21 Acetylcholine Binding Protein: empty or antagonist-bound

22 Of Cours 3 Slide 22 Acetylcholine Binding Protein: empty or agonist-bound

23 Of Cours 3 Slide 23 Structure 3-D Récepteur AcCh

24 Of Cours 3 Slide 24

25 Of Cours 3 Slide 25 Acetylcholine Binding Protein AcChol

26 Of Cours 3 Slide 26 Activation of acetylcholine R

27 Of Cours 3 Slide 27 Conclusion: Nombre limité de conformations: ouvert, fermé, désensibilisé La conformation ouverte est « sur le chemin » entre la conformation fermée et désensibilisée. Le passage direct entre la conformation fermée et la conformation désensibilisée semble (généralement) très improbable. (forte barrière énergétique?)

28 Récepteurs cytosoliques et nucléaires Conformation dépendante du ligand (Main dans un gant)

29 Of Cours 3 Slide 29 GR HSP90 p59 Protein synthesis Preinitiation complex GR

30 Of Cours 3 Slide 30 Structure modulaire:

31 Of Cours 3 Slide 31 PCAF CBP/p300 Sp1 c-Jun c-Fos RNAPII TBP TFIIF TFIIA TFIIB TFIIE TFIID TFIIH RNAPII TBP Two mechanisms of ER transcriptional activation Direct (Binding to ERE) Indirect ( Binding to other TFs) ERE AP1 GC TATA TFIIF TFIIA TFIIB TFIIE TFIID TFIIH TATA ER

32 Of Cours 3 Slide 32 DNA Binding? Minor groove Major groove

33 Of Cours 3 Slide 33 DNA Binding domain:

34 Of Cours 3 Slide 34 Ligand Binding Domain:

35 Of Cours 3 Slide 35 Estrogen-receptor recognition:

36 Of Cours 3 Slide 36 Laszlo Nagy and John W.R. Schwabe, TRENDS in Biochemical Sciences Vol.29 No.6 June 2004 Empty, inactive and active ligand-bound receptors

37 Of Cours 3 Slide 37 Cinétiques de liaison? Courbes dose-effet? Albers et al, JBC 2006

38 Of Cours 3 Slide 38 Conclusion: Il y a autant de conformations « actives » que de ligands Lactivité biologique de chaque ligand dépend de laffinité relative des coactivateurs et des corépresseurs pour le complexe ligand- récepteur. Un composé peut être agoniste partiel soit parce quil reconnaît les coactivateurs avec une mauvaise affinité, soit parce quil reconnaît également coactivateurs et coinhibiteurs

39 Récepteurs de linsuline Tyrosine kinase, 1 TM helix; Coopérativité négative, Relations liaison – activation?

40 Of Cours 3 Slide 40 Surinya, K. H. et al. J. Biol. Chem. 2002;277: Courbes de compétition, de saturation 1 site ou 2 sites ?

41 Of Cours 3 Slide 41 Surinya, K. H. et al. J. Biol. Chem. 2002;277: Cinétique de dissociation avec ou sans excès dinsuline

42 Of Cours 3 Slide 42 S S Y1146 Y1151 Y960 Y1316 Y1322 Kinase Y1150 S S Y1146 Y1151 Y960 Y1316 Y1322 Kinase Y1150 S S Insulin Receptor α – Bindingβ – tyrosine kinase

43 Of Cours 3 Slide 43 Insulin: two binding sites

44 Of Cours 3 Slide 44 SNI INS InsulinR α subunit

45 Of Cours 3 Slide 45 Insulin INSULIN RECEPTOR

46 Of Cours 3 Slide 46 Insulin INSULIN RECEPTOR

47 Of Cours 3 Slide 47 Insulin INSULIN RECEPTOR

48 Of Cours 3 Slide 48 Dose-effet [Insuline] (log M) [Physiologiques]

49 Of Cours 3 Slide 49 pY699 STAT 5 Insulin Receptor Signaling Effects on gene expression Y1146 Y1151 Y960 Y1316 Y1322 Kinase Y1150 Y1146 Y1151 Y960 Y1316 Y1322 Kinase Y1150 SH2 PTB PH RAS Y699 STAT 5B STAT 5B pathway Y Y IRS-1/2 pY PH STAT 5 pY699 STAT 5 pY699 RAF AP-1 Insulin S S S S S S TCF FOXO1 PP Proline rich PKB mTOR PDK p70 S6K GSK3β BAD Caspase 9 p27 KIP NFκB IKK CRE SOS PP GRB2 PI3K MEK1/2 ERK1/2 aPKC

50 Of Cours 3 Slide 50 Conclusion 2 états du R insuline: oAu repos, en labsence dinsuline: hélices TM mal placées donc TyrKinase inactive, oEn présence dinsuline: Tyr kinase active, autophosphorylation, recrutement de protéines de signalisation. Liaison: Possibilité de liaison simultanée de 2 insulines/R. Coopérativité négative entre les deux sites de liaison.


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