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Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis.

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1 Etude structurale du système de sécrétion de type IV chez Brucella suis

2 Les bactéries Gram négatives possèdent plusieurs systèmes pour transférer le matériel génétique. Lun de ces mécanismes est le système de conjugaison.

3 Ce mécanisme a été détourné par différentes bactéries pour dautres transferts de macromolécules que celui de matériel génétique = système de sécrétion de type IV

4 Echantillon des systèmes de sécrétion de type IV (Covacci et al, 1999)

5 Schéma hypothétique du système de sécrétion de type IV chez Agrobacterium tumefaciens Les composants du système de sécrétion sont codés par un opéron nommé virB (Covacci et al, 1999) B1

6 La bactérie d intérêt dans ce travail est Brucella suis. - Coccobacille Gram-négatif - Zoonose affectant quelquefois l homme. - Pathogène intracellulaire - Famille des -2 Protéobactériacées comme Agrobacterium tumefaciens Cette bactérie se développe, in vitro, dans les cellules HeLa et dans les macrophages, grâce à une déviation de la voie classique dendocytose.

7 Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp endocytose Dégradation enzymatique Interaction phagosome Endosome précoce Endosome tardif Lysosome Brucella Interaction Autophagosome Vacuole de réplication Reticulum endoplasmique Intervention du système de type IV

8 Les ORFs de ces deux opérons partagent un pourcentage d identité moyen de 26% (19,5 à 31 %) (O Callaghan et al, 1999)

9 Objectif de ce travail : Utilisation d une approche bioinformatique en vue de voir si on peut appliquer le schéma du système de sécrétion de type IV dAgrobacterium tumefaciens à Brucella suis.

10 Les étapes suivies : 1) Collecter des informations au départ des séquences protéiques : - les localisations cellulaires - les motifs - les structures secondaires et tertiaires 2) Analyse plus approfondie de composants pour lesquels nous aurons pu proposer une fonction

11 La méthodologie : 1) Recherche dhomologues (Blast) - Banque non redondante - Banque de structures (PDB) - Banque dESTs humaines Les composants des systèmes de type IV La relation structure/fonction Interaction avec lhôte 2) Prédiction de localisation sub-cellulaire (PSORT) - 4 localisations - Ne prédit pas encore la sécrétion - Prédictions fiables (cas-tests) - Localise une peu trop souvent en membrane interne

12 La méthodologie (suite) : 4) Prédiction de structures secondaires (PHD) - Localisation des structures secondaires - Prédiction dhélices transmembranaires - Prédiction des résidus enfouis et exposés - Validation des localisations sub-cellulaires 3) Détection de motifs a) Caractérisation dune famille protéique (Blocks) b) Recherche de motifs fonctionnels (Prosite)

13 La méthodologie (fin) : 5) Prédiction de structures tertiaires (3D-PSSM, Ucla-Doe) - Similarité de repliement protéique Relation structure / fonction

14 Résultats du débroussaillage du système de sécrétion de type IV chez B. suis Agrobacterium tumefaciensBrucella suis B1

15 - 8 protéines du système de sécrétion de type IV dA. tumefaciens peuvent être transposées à B. suis. - Des fonctions ont pu être proposées ou renforcées pour deux composants du système : VirB1 et VirB5. Conclusions du débroussaillage :

16 La protéine VirB1 et son homologie avec les lysozymes

17 La fonction proposée, dans la littérature, pour VirB1 est la dégradation du peptidoglycane qui est aussi une des fonctions que remplissent les lysozymes.

18 Les topologies de VirB1 et du lysozyme sont comparables C N C N Lysozyme VirB1

19 Lysozyme complexé avec du NAG

20 La protéine VirB5 et son homologie avec la MAP1A (Microtubule Associated Protein 1A)

21 VirB5 ne partage pas le motif de liaison aux microtubules. Domaines identifiés sur la MAP1A (2805 aa) (ProDom) PD (K/R)(K/R)(D/E) Motif de liaison aux microtubules Ce qui s aligne À VirB5 NC

22 Ce bloc PD est conservé par beaucoup dautres familles protéiques. Il s agit en fait dun coiled coil

23 Voici un échantillon des protéines qui partagent ce motif coiled coil: Protéines liant lADN : - protéines activatrices - élément de dimérisation de facteurs de transcription Famille des v-SNARE et t-SNARE Intéressant Protéines fibreuses Apolipoprotéines

24 Schéma dinteraction entre v-SNARE et t-SNARE Membrane vacuolaire Membrane organite RE, Golgi

25 Trafic intracellulaire classique // Trafic intracellulaire de Brucella sp endocytose Dégradation enzymatique Interaction phagosome Endosome précoce Endosome tardif Lysosome Brucella Interaction Autophagosome Vacuole de réplication Reticulum endoplasmique Intervention du système de type IV

26 Conclusions : - Nous avons pu transposer 8 composants du système de sécrétion de type IV dA. tumefaciens à B. suis. - VirB1 dégraderait le peptidoglycane - VirB5 est le candidat préférentiel pour le détournement du trafic intracellulaire - Discussion sur la méthode employée

27 Perspectives : - Validation de la fonction enzymatique de VirB1 en mutant les résidus conservés dans le site actif dun lysozyme (mutagenèse dirigée) - Validation de la fonction de VirB5 par différentes manipulations (co- immunoprécipitation, …). - Analyse approfondie dautres composants du complexe.


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