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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES

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1 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES

2 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

3 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

4 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

5 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

6 Recherche de mutations récurrentes
Un gène – une mutation Un gène-des mutations majoritaires … de nombreux outils adaptés

7 Allèles anormaux (> 36 CAG ) Allèles normaux ( 30 CAG )
Maladie de Huntington Allèles anormaux (> 36 CAG ) Allèles normaux ( 30 CAG )

8 Le Gène : (CGG)n Gène FMR1, localisé en Xq27.3
Diagnostic Direct et analyse fonctionnelle Syndrome de retard mental lié à l ’X Le Gène : Gène FMR1, localisé en Xq27.3 FMRP : RNA binding protéine Présence d ’une expansion d ’un motif trinucléotidique répété « CGG » au niveau de l ’extrémité 5 ’non traduite du gène (CGG)n ...Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine- Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine...

9 Diagnostic Direct Syndrome de retard mental lié à l ’X
Southern Blot Femme prémutée Homme mosaïque Femme mosaïque M PM F H Homme normal Femme normale Homme prémuté Homme muté Femme mutée 5,2 kb EcoRI normal Muté Méthylé NI Prémuté No Méthylé 2,8 kb EcoRI+EagI normal NA Blot Interprétation des profils

10 Diagnostic direct d ’une lésion de l ’ADN par PCR
45 48 19 17 5 8 12 44 4 Dystrophie musculaire de Duchenne MWM M T EXON pm 3 43 50 13 6 47 60 52 Deux réactions permettent d ’amplifier simultanément à l ’aide de 18 couples d ’amorces spécifiques, 18 exons du gène de la dystrophine et les jonctions introns-exons correspondantes. Elles permettent ainsi de diagnostiquer la délétion d ’un ou plusieurs de ces exons chez les malades atteints de myopathie de Duchenne/Becker.

11 Oligonucleotide Ligation Assay
ADN Normal Sonde commune Fluorochrome A G Ligation dénaturation G OLA Normal

12 Oligonucleotide Ligation Assay
ADN Muté Sonde commune Fluorochrome Ligation dénaturation A OLA muté

13 OLA

14 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

15 Recherche de mutations inconnues
Techniques multiples de détection

16 PAX6 Nonsense Mutations Exon 11 (R317X)
Size marker Undigested R317X Control PCR/HaeIII Heterozygous Codon 317 CAG  TAG Sequence nt 1311 CT Controls SSCP Controls nt 1311 CT DGGE

17 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

18 Critères d’implication d’une variation nucléotidique dans un phénotype (pathologique)
évident (modification radicale de la protéine) Absence d’ARNm ou de protéine Perte de la fonction de la protéine in vitro ou dans un modèle (test fonctionnel) modification de l’ARNm Arguments probabilistes Histoire familiale corrélations mode de transmission/ phénotype ; phénotype/génotype Arguments biologiques (éventuellement in sillico) nature du changement d’acide aminé éloignement du consensus pour une séquence signal ... Comparaison en population mutations comparables et leurs effets pathogènes conservation du résidu modifié dans une famille de gène (intraspécifique) ou une analyse phylogénétique (interspécifique) présence de la variation dans une population normale comparable

19 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

20 Le Diagnostic Indirect
Marqueur 1 Ici Marqueur 2 Marqueur 3 Marqueur 4

21 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

22 Diagnostic Indirect (affection AD)

23 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de l’anomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d ’un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d ’un haplotype polymorphe lié à l ’anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

24 Phénomène de recombinaison
+ 1cM 3cM m + P=0,01 ou m + P=0,03 ou m + P=0,0003 ou

25 5°) Le diagnostic anténatal
4°) Prescription a) consultation préalable appropriée b) obtention du consentement éclairé c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) c) prise en charge de la grossesse en cours d) rendu des résultats e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

26 5°) Le diagnostic anténatal
4°) Prescription a) consultation préalable appropriée b) obtention du consentement éclairé c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) c) prise en charge de la grossesse en cours d) rendu des résultats e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

27 Le consentement éclairé
Obligatoire doit porter sur des renseignements précis doit faire l’objet d’un document écrit doit être compris par le patient ou ses ayant-droits Les cas particuliers enfants les titulaires de l’autorité parentale et éventuellement l’enfant lui même les majeurs incapacités tuteur ou curateur les impossibilités personne de confiance déclarée famille L’attestation d’obtention du consentement. Le consentement éclairé Unicité de la recherche Autorisation du laboratoire Découvertes fortuites Incertitude sur le succès Durée des examens Conservation des échantillons Modalités de rendu diagnostique Caractère facultatif

28 5°) Le diagnostic anténatal
4°) Prescription a) consultation préalable appropriée b) obtention du consentement éclairé c) rendu des résultats Abord du patient Lecture d’un compte rendu d’analyse moléculaire pour le praticien 5°) Le diagnostic anténatal a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) c) prise en charge de la grossesse en cours d) rendu des résultats e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

29 Rendu des résultats par le médecin prescripteur du test qui est le seul destinatiare des résultats… Au cours d’une consultation appropriée Eventuel suivi Lecture d’un compte rendu de diagnostic moléculaire à l’usage du praticien Notion de nomenclature internationale des mutations

30 Nomenclature des mutations
Description au niveau nucléotidique Base de description la séquence génomique : g. La séquence de l’ADNc : c. Les substitutions g.11223G>A = substitution d’une guanosine par une adénosine en position de la séquence c.542T>C (le nucléotide N° 1 est le premier nucléotide du codon d’initiation de la traduction (A de l’ATG)) Cas des introns c.641+2T>A ou IVSn+2T>A c.642-1G>T ou IVSn-1G>T Séquence de référence précisée. Les délétions et les insertions « del » ou « ins » c.266_271del6 ou c.266_271delTTACCA

31 Description au niveau protéique
p.Q36X ou p.Gln36stop ou p.Gln36X p.R40W ou p.Arg40Trp Description de mutation à effet plus complexe Exemple mutations décalantes du cadre de lecture c.642_643insCfsX18 p.Ala214AlafsX6 Lecture du compte rendu 1°) la technique employée 2°) le résultat brut Présence d’une mutation [c.24C>T]+[=] dont l’impact protéique est [p.Lys8Arg]+[=] 3°) le commentaire La mutation p.Lys8Arg présente à l’état hétérozygote est décrite de manière récurente dans la population européenne. Elle est responsable du phénotype du patient. Elle se transmet en dominance et, sa présence doit faire conseiller une consultation spécialisée de génétique pour informer le proposant des risques et engager une éventuelle enquête familiale.

32 Précisions, questions et description des mutations complexes :
dmd.mutnomen.html

33 5°) Le diagnostic anténatal
4°) Prescription a) consultation préalable appropriée b) obtention du consentement éclairé c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) c) prise en charge de la grossesse en cours d) rendu des résultats e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

34 5°) Le diagnostic anténatal
4°) Prescription a) consultation préalable appropriée b) obtention du consentement éclairé c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) c) prise en charge de la grossesse en cours d) rendu des résultats e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

35 Consentement de la femme enceinte
Elle a eu et compris les informations suivantes Mode de pratique du DPN Nature et limite des examens réalisés Risques liés au prélèvement Délai d’obtention des résultats Remise et explication des résultats Il n’y a en acun cas un engagement à la réalisation d’une interruprion de la grossesse si le fœtus est atteint de la maladie recherchée

36 5°) Le diagnostic anténatal
4°) Prescription a) consultation préalable appropriée b) obtention du consentement éclairé c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) c) prise en charge de la grossesse en cours d) rendu des résultats e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

37 Date : - Choriocentèse: 10 - 14 SA Villosités : annexes
CHORIOCENTESE et / ou PLACENTOCENTESE Utérus Embryon / Foetus Chorion / Placenta Pince Date : - Choriocentèse: SA - Placento : SA Villosités : annexes Risque : - F.C. 1 à 1,5 % - erreur 1 % Intérêt : - gène ++++ - chs ++ - enzyme +++

38 AMNIOCENTESE aiguille utétus Date: 14 - 30 SA Cellules Amniotiques
Risque: - F.C. 0,5 % - erreur 1/10000 Intérêt: - gène ++ - chs ++++ - enzyme +++ - hormone ++++ fœtus

39 CORDOCENTESE Date: 22 - 38 SA Sang Foetal Risque: - F.C. 1 %
- erreur 1/1000 Intérêt: - gène + - chs +++ - enzyme ++ aiguille utérus Cordon ombilical fœtus

40 5°) Le diagnostic anténatal
4°) Prescription a) consultation préalable appropriée b) obtention du consentement éclairé c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) c) prise en charge de la grossesse en cours d) rendu des résultats e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

41 5°) Le diagnostic anténatal
4°) Prescription a) consultation préalable appropriée b) obtention du consentement éclairé c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) c) prise en charge de la grossesse en cours d) rendu des résultats e) l’interruption volontaire de grossesse pour motif médical

42 Prise de décision multidisciplinaire
Diagnostic d’une “maladie d’une particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic” Prise de décision multidisciplinaire Néonatologiste Echographiste Obstétricien Généticien Organisé en Centre de Diagnostic Prénatal

43 Références : Génétique moléculaire humaine T. STRACHAN , AP READ, Flammarion Médecine-Sciences (2ème édition française 1998) Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire, clinique. Collège National des enseignants et praticiens de Génétique Médicale, 2004, MASSON Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire, clinique. Collège National des enseignants et praticiens de Génétique Médicale,


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