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DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES. 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic.

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1 DIAGNOSTIC MOLECULAIRE DES MALADIES GENETIQUES

2 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de lanomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d un haplotype polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

3 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de lanomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d un haplotype polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

4 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de lanomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d un haplotype polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

5 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de lanomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d un haplotype polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

6 Recherche de mutations récurrentes Un gène – une mutation Un gène-des mutations majoritaires … de nombreux outils adaptés

7 Maladie de Huntington Allèles anormaux (> 36 CAG ) Allèles normaux ( 30 CAG )

8 Diagnostic Direct et analyse fonctionnelle Syndrome de retard mental lié à l X Le Gène : –Gène FMR1, localisé en Xq27.3 –FMRP : RNA binding protéine –Présence d une expansion d un motif trinucléotidique répété « CGG » au niveau de l extrémité 5 non traduite du gène (CGG)n... Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine- Cytosine-Guanine-Guanine-Cytosine-Guanine-Guanine...

9 Diagnostic Direct Syndrome de retard mental lié à l X Southern Blot Blot 2,8 kb EcoRI+EagI normal 5,2 kb EcoRI normal MutéMéthylé NI Prémuté No Méthylé NA Homme normal Femme normale Homme prémuté Femme prémutée Homme muté Femme mutée Homme mosaïque Femme mosaïque Interprétation des profils MM PM F H

10 Diagnostic direct d une lésion de l ADN par PCR Deux réactions permettent d amplifier simultanément à l aide de 18 couples d amorces spécifiques, 18 exons du gène de la dystrophine et les jonctions introns-exons correspondantes. Elles permettent ainsi de diagnostiquer la délétion d un ou plusieurs de ces exons chez les malades atteints de myopathie de Duchenne/Becker Dystrophie musculaire de Duchenne MWM MMTT EXON pm

11 Oligonucleotide Ligation Assay C ADN Normal Sonde commune FluorochromeAG G Ligation dénaturation OLA Normal

12 Oligonucleotide Ligation AssayGA T ADN Muté Sonde commune Fluorochrome A Ligation dénaturation OLA muté

13 OLA

14 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de lanomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d un haplotype polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

15 Recherche de mutations inconnues Techniques multiples de détection

16 PAX6 Nonsense Mutations Exon 11 (R317X) Size marker Undigested R317X Control PCR/HaeIII Controls nt 1311 C T SSCP Controls nt 1311 C T DGGE Heterozygous Codon 317 CAG TAGSequence

17 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de lanomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d un haplotype polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

18 Critères dimplication dune variation nucléotidique dans un phénotype (pathologique) –évident (modification radicale de la protéine) Absence dARNm ou de protéine Perte de la fonction de la protéine in vitro ou dans un modèle (test fonctionnel) modification de lARNm –Arguments probabilistes Histoire familiale –corrélations mode de transmission/ phénotype ; phénotype/génotype Arguments biologiques (éventuellement in sillico) –nature du changement dacide aminé –éloignement du consensus pour une séquence signal –... Comparaison en population –mutations comparables et leurs effets pathogènes –conservation du résidu modifié dans une famille de gène (intraspécifique) ou une analyse phylogénétique (interspécifique) –présence de la variation dans une population normale comparable

19 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de lanomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d un haplotype polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

20 Le Diagnostic Indirect Ici Marqueur 1 Marqueur 2 Marqueur 3 Marqueur 4

21 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de lanomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d un haplotype polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

22 Diagnostic Indirect (affection AD)

23 1°) Indications a) Conseil génétique et diagnostic anténatal b ) Diagnostic de confirmation c ) Diagnostic prédictif (présymptomatique) 2°) Recherche de lanomalie génétique (en fonction du mode de transmission mendélien ) diagnostic direct. a) problèmes posés par les mutations récurentes b) problèmes posés par les mutations inconnues i) diagnostic direct évident ii) validation de la responsabilité d un variant moléculaire 3°) Analyse de la ségrégation d un haplotype polymorphe lié à l anomalie a) marqueurs polymorphes juxta- et intra-géniques (analyse indirecte et semi-directe) b ) analyse familiale c) diagnostic probabiliste

24 Phénomène de recombinaison m + 1cM 3cM m + P=0,01 ou m + P=0,03 ou m + P=0,0003 ou

25 4°) Prescription –a) consultation préalable appropriée –b) obtention du consentement éclairé –c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal –a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) –b) obtention du consentement éclairé –c) prise en charge de la grossesse en cours –d) rendu des résultats –e) linterruption volontaire de grossesse pour motif médical

26 4°) Prescription –a) consultation préalable appropriée –b) obtention du consentement éclairé –c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal –a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) –b) obtention du consentement éclairé –c) prise en charge de la grossesse en cours –d) rendu des résultats –e) linterruption volontaire de grossesse pour motif médical

27 Le consentement éclairé –Obligatoire doit porter sur des renseignements précis doit faire lobjet dun document écrit doit être compris par le patient ou ses ayant-droits –Les cas particuliers enfants –les titulaires de lautorité parentale et éventuellement lenfant lui même les majeurs incapacités –tuteur ou curateur les impossibilités –personne de confiance déclarée –famille Lattestation dobtention du consentement. Le consentement éclairé –Unicité de la recherche –Autorisation du laboratoire –Découvertes fortuites –Incertitude sur le succès –Durée des examens –Conservation des échantillons –Modalités de rendu diagnostique –Caractère facultatif

28 4°) Prescription –a) consultation préalable appropriée –b) obtention du consentement éclairé –c) rendu des résultats –Abord du patient –Lecture dun compte rendu danalyse moléculaire pour le praticien 5°) Le diagnostic anténatal –a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) –b) obtention du consentement éclairé –c) prise en charge de la grossesse en cours –d) rendu des résultats –e) linterruption volontaire de grossesse pour motif médical

29 Rendu des résultats –par le médecin prescripteur du test qui est le seul destinatiare des résultats… –Au cours dune consultation appropriée –Eventuel suivi Lecture dun compte rendu de diagnostic moléculaire à lusage du praticien –Notion de nomenclature internationale des mutations

30 Nomenclature des mutations Description au niveau nucléotidique –Base de description la séquence génomique : g. La séquence de lADNc : c. –Les substitutions g.11223G>A = substitution dune guanosine par une adénosine en position de la séquence c.542T>C (le nucléotide N° 1 est le premier nucléotide du codon dinitiation de la traduction (A de lATG)) Cas des introns –c.641+2T>A ou IVSn+2T>A –c.642-1G>T ou IVSn-1G>T Séquence de référence précisée. –Les délétions et les insertions « del » ou « ins » c.266_271del6 ou c.266_271delTTACCA

31 Description au niveau protéique –p.Q36X ou p.Gln36stop ou p.Gln36X –p.R40W ou p.Arg40Trp Description de mutation à effet plus complexe –Exemple mutations décalantes du cadre de lecture c.642_643insCfsX18 p.Ala214AlafsX6 Lecture du compte rendu –1°) la technique employée –2°) le résultat brut Présence dune mutation [c.24C>T]+[=] dont limpact protéique est [p.Lys8Arg]+[=] –3°) le commentaire La mutation p.Lys8Arg présente à létat hétérozygote est décrite de manière récurente dans la population européenne. Elle est responsable du phénotype du patient. Elle se transmet en dominance et, sa présence doit faire conseiller une consultation spécialisée de génétique pour informer le proposant des risques et engager une éventuelle enquête familiale.

32 Précisions, questions et description des mutations complexes : –http://www. dmd.mutnomen.html

33 4°) Prescription –a) consultation préalable appropriée –b) obtention du consentement éclairé –c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal –a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) –b) obtention du consentement éclairé –c) prise en charge de la grossesse en cours –d) rendu des résultats –e) linterruption volontaire de grossesse pour motif médical

34 4°) Prescription –a) consultation préalable appropriée –b) obtention du consentement éclairé –c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal –a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) –b) obtention du consentement éclairé –c) prise en charge de la grossesse en cours –d) rendu des résultats –e) linterruption volontaire de grossesse pour motif médical

35 Consentement de la femme enceinte Elle a eu et compris les informations suivantes –Mode de pratique du DPN –Nature et limite des examens réalisés –Risques liés au prélèvement –Délai dobtention des résultats –Remise et explication des résultats Il ny a en acun cas un engagement à la réalisation dune interruprion de la grossesse si le fœtus est atteint de la maladie recherchée

36 4°) Prescription –a) consultation préalable appropriée –b) obtention du consentement éclairé –c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal –a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) –b) obtention du consentement éclairé –c) prise en charge de la grossesse en cours –d) rendu des résultats –e) linterruption volontaire de grossesse pour motif médical

37 CHORIOCENTESE et / ou PLACENTOCENTESE Date : - Choriocentèse: SA - Placento : SA Villosités : annexes Risque : - F.C. 1 à 1,5 % - erreur 1 % Intérêt : - gène chs ++ - enzyme +++ Utérus Embryon / Foetus Chorion / Placenta Pince

38 AMNIOCENTESE Date: SA Cellules Amniotiques Risque: - F.C. 0,5 % - erreur 1/10000 Intérêt: - gène++ - chs enzyme hormone ++++ aiguille fœtus utétus

39 CORDOCENTESE Date: SA Sang Foetal Risque: - F.C. 1 % - erreur 1/1000 Intérêt: - gène+ - chs enzyme ++ aiguille Cordon ombilical utérus fœtus

40 4°) Prescription –a) consultation préalable appropriée –b) obtention du consentement éclairé –c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal –a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) –b) obtention du consentement éclairé –c) prise en charge de la grossesse en cours –d) rendu des résultats –e) linterruption volontaire de grossesse pour motif médical

41 4°) Prescription –a) consultation préalable appropriée –b) obtention du consentement éclairé –c) rendu des résultats 5°) Le diagnostic anténatal –a) consultation(s) préalable(s) appropriée(s) –b) obtention du consentement éclairé –c) prise en charge de la grossesse en cours –d) rendu des résultats –e) linterruption volontaire de grossesse pour motif médical

42 Diagnostic dune maladie dune particulière gravité reconnue comme incurable au moment du diagnostic Prise de décision multidisciplinaire –Néonatologiste –Echographiste –Obstétricien –Généticien Organisé en Centre de Diagnostic Prénatal

43 Références : –Génétique moléculaire humaine T. STRACHAN, AP READ, Flammarion Médecine-Sciences (2 ème édition française 1998) –Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire, clinique. Collège National des enseignants et praticiens de Génétique Médicale, 2004, MASSON –Génétique Médicale : formelle, chromosomique, moléculaire, clinique. Collège National des enseignants et praticiens de Génétique Médicale,


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