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Travaux dirigés Immunologie BIOL 360 : Anticorps monoclonaux Université Paris-Sud 11 Ophélie JOLY Marie GUILBAUD Guillaume LEGRAND Clément GAND Année 2013/2014.

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1 Travaux dirigés Immunologie BIOL 360 : Anticorps monoclonaux Université Paris-Sud 11 Ophélie JOLY Marie GUILBAUD Guillaume LEGRAND Clément GAND Année 2013/2014 L3S6 parcours Biologie Santé

2 PLAN Introduction Etape dimmunisation Coopérations cellulaires mises en place après immunisation Etape de fusion ou obtention des hybridomes Etape de sélection Etapes de criblage et de clonage des hybridomes Comparaison anticorps monoclonaux et polyclonaux Techniques développées à partir des anticorps

3 Anticorps = Protéine utilisée par le système immunitaire en réaction à lintroduction dun pathogène dans lorganisme. Sont sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B : les plasmocytes. Introduction Les anticorps Ag Paratope Epitope Epitope (déterminant antigénique) = Molécule pouvant être reconnue par un paratope, partie variable d'un anticorps Paratope = Partie de l'anticorps qui assure la fonction de reconnaissance de l'antigène.

4 Anticorps avant immunisation Animal non immunisé IgM IgG IgA Limmunisation produits lors de contacts avec dautres Ag que la protéine purifiée Titre Ac Jours Semaines Mois Question 1

5 Anticorps après immunisation Animal immunisé par injection dune protéine purifiée Après 1 ère injection (réaction primaire) Limmunisation Sélection LB Prolifération LB Deviennent effecteurs ou LB mémoires IgG IgM Présence dIgM puis dIgG Production dAc anti-protéine Question 1

6 Anticorps après immunisation Animal immunisé par injection dune protéine purifiée Après 2 nde injection (réaction secondaire) LB mémoire activé plus rapidement Réponse + importante, + rapide, + spécifique Après n ème injection Limmunisation IgG IgM Production dAc anti-protéine: + grande quantité, de meilleure qualité Question 1

7 Haptène et anticorps monoclonaux Haptène = Antigène non immunogène, trop petite pour générer une réponse immunitaire seule Exemple dhaptène : DiNitroPhénol = DNP Induction dune réponse immunitaire par conjugaison avec une molécule transporteuse (BSA, OVA,..) : Doit être soluble Doit être un corps étranger à lanimal Doit avoir un temps de ½ vie suffisamment long Limmunisation Question 2

8 Réponse anticorps anti-DNP Production danticorps anti-DNP Question 5 Coopérations cellulaires Association haptène-protéine porteuse rend immunogène le DNP

9 Anticorps monoclonaux Immunisation de lanimal avec lAg contre lequel on veut un Ac monoclonal Pour la production dAc spécifique de lAg utilisé Réponse immunitaire adaptative Production Ac en plus grande quantité Production Ac de meilleure qualité et plus affin Limmunisation Question 3

10 Système immunitaire et administration de lantigène Lieu dadministration de lAg important Quand administration dans la voie systémique (SC, ID, IM..) Limmunisation Circulation vers les Organes Lymphoides Secondaires Contact rapide avec les cellules du Système Immunitaire Question 4

11 Cellules B et réponse anticorps anti-DNP Plasmocyte = LB différencié capable de produire des anticorps. Myélome = Cancer hématologique (se développe à partir de cellules hématopoïétiques) de la moelle osseuse caractérisée par une prolifération des lymphocytes B. Obtention des hybridomes Question 6

12 Fusion et cellules spléniques Cellules spléniques = Cellules de la rate Obtention des hybridomes Cellules myélomateuses = Cellules cancéreuses Questions 7/8 Capacité de production des Ac spécifiques de lAg utilisé pour immuniser le donneur Croissance illimitée

13 Technique des hybridomes Obtention dhybridomes : Clones immortels synthétisant lAc monoclonal recherché Obtention des hybridomes Clonage de lhybridome sélectionné Immunisation contre lAg Fusion cellules spléniques/myélomateuses Sélection sur milieu spécifique Sélection des hybridomes fabriquant lAc anti-Ag Question 6

14 HGPRT : Hypoxanthine-Guanine PhosphoRibosylTransférase Enzyme permettant synthèse de nucléotides par voie de récupération Cellules spléniques : HGPRT+ Cellules myélomateuses : HGPRT- HAT : Hypoxantine Aminopterine Thymidine Aminoptérine : Inhibe synthèse de novo de nucléotides Sélection des hybridomes Sélection Milieu de sélection dhybridomes : HAT Question 11

15 Fusion et tissus lymphoïdes Tissu lymphoïde pouvant être utilisé pour la fusion : Les ganglions lymphatiques Les MALT (Tissus Lymphoides Associés aux Muqueuses) Obtention des hybridomes Dans organes lymphoïdes secondaires : Présence de LB Lieu de rencontre LB/Ag Lieu dactivation des LB Lieu de production Ac anti-Ag Question 8

16 Hyperimmunisation Hyperimmunisation = Injection de doses croissantes dAg But : Obtention dune concentration importante de plasmocytes et donc dAc spécifique de lAg dintérêt Obtention des hybridomes Taux dAc (UI/mL) Evolution de la quantité dAc selon le nombre dinjections Question 10

17 Caractéristiques des myélomes Cellules myélomateuses utilisées: Immortelles Incapables de secréter Ac HGPRT- : Incapables de synthétiser nucléotides par voie de récupération Sélection Question 12

18 Sélection des hybridomes/anticorps anti-DNP But : Sélectionner les hybridomes produisant des Ac anti-DNP Criblage et clonage Dosages de liaison Ac/Ag RIA/ELISA Marquage fluorescent de lAc Immunofluorescence (Immunohistochimie/Immunocytochimie) Cytométrie de flux Essai de cytotoxicité : Evaluation de la viabilité des Ag après mise en contact avec les lymphocytes. Question 13

19 Clonage de lhybridome Clonage par dilution limite Principe Criblage et clonage But : Sélection dun clone produisant un seul type danticorps Dilution du mélange dhybridomes (1 cellule/puit) 1ère série de dilution : Sélection des cellules sécrétant lAc en quantité 2ème série : Vérification de la pureté de la lignée cellulaire 3ème série : 2ème Vérification du clonage Obtention dun sérum monoclonal Question 14

20 Sérum polyclonal Sérum = Liquide provenant du sang coagulé et centrifugé, contient des Ac polyclonaux Antisérum = Sérum prélevé chez un individu/animal immunisé. Contient des Ac polyclonaux spécifiques de lAg administré Ac monoclonaux Ac Polyclonaux Question 15

21 Avantages des anticorps polyclonaux/monoclonaux Anticorps monoclonal Spécificité : Ac dirigé vers un seul épitope de lAg Affinité : Ac très affin Production en grande quantité Constance de ces Ac Production longue et couteuse Anticorps polyclonal Diversité : Reconnaissance dun Ag sur différents épitopes Différents Ac peuvent fixer un même Ag Fixation moins « critique » Ac monoclonaux Ac Polyclonaux Anticorps monoclonaux, liaison à un épitope spécifique Anticorps polyclonaux, liaison à des épitopes différents Question 16

22 Techniques utilisant des anticorps En diagnostic : Techniques En thérapeutique : Question 17 Immunoblot Immunofluorescence Agglutination et hémagglutination Réaction de fixation du complément Immunochromatographie Immunoprécipitation Cytométrie de flux Radio-Immuno-Assays (RIA) Enzym Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) Immunothérapie

23 Diagnostic Immunoblot (Cas du VIH) Techniques Question 17 Dissociation par un détergent du pathogène Séparation des protéines constitutives du pathogène par SDS PAGE Transfert sur membrane de nitrocellulose et incubation avec un antiserum (contenant Ac polyclonaux anti-VIH) Détection des Ac fixés aux Ag par un Ac secondaire couplé à une enzyme Mise en évidence des anticorps dirigés contre le pathogène dans le sérum des patients infectés

24 Diagnostic Immunofluorescence Techniques Question 17 1 er marquage : Fixation de lAc monoclonal primaire sur lAg 2 ème marquage : Fixation de lAc polyclonal secondaire sur lAc primaire. LAc secondaire est couplé à un fluorochrome Détection du complexe Ac/Ag au microscope électronique à fluorescence Recherche dun pathogène

25 Hemagglutination (Détermination du groupe sanguin) Techniques Question 17 Diagnostic Prélèvement sanguin dun patient Mise en contact Ac/GR Agglutination : Ac reconnait la structure antigénique portée par le GR. Pas agglutination : Ac ne reconnait pas la structure antigenique portée par le GR.

26 Réaction de fixation du complément Question 17 Diagnostic Techniques Ajout dans le sérum de lAg et du complément Si présence de lAc anti-Ag dans le sérum, fixation Ac/Ag/Complément Ajout de GR et dAc anti-GR Si le complément est fixé avec le complexe Ac/Ag, ne peut se fixer au complexe GR/Ac anti-GR : Absence dhémolyse Si le complément nest pas fixé au complexe Ac/Ag (car absence dAc), se fixe au complexe GR/Ac anti-GR : Hémolyse Test négatif Test positif

27 Immunochromatographie (Cas du test de grossesse) Techniques Question 17 Diagnostic En cas de grossesse, il y a production dhCG retrouvé dans le sang et lurine Fixation de lhormone sur lAc anti-hCG Migration du complexe Ac/Ag jusquà reconnaissance de lAg par un 2 ème Ac spécifique : Arrêt de la migration dans la zone test Utilisations possibles pour la détection : VIH, Paludisme, Peste, Cholera,..

28 Immunoprécipitation Techniques Marquage métabolique Marquage protéines Marquage des cellules Lyse Ajout dAc fixées Lavage Séparation sur des billes SDS-PAGE Question 17 Diagnostic Marquage des cellules par un acide aminé radioactif Lyse des cellules par un détergent : Obtention Ag + Débris cellulaires Ajout dAc monoclonaux fixées sur des billes Lavage : Elimination des Ag non fixées pas un Ac et des débris cellulaires Séparation des Ag par SDS PAGE : Migration des Ag selon la taille

29 Technique du phage display Diagnostic Techniques Question 17

30 Immunothérapie But : Cibler spécifiquement les cellules tumorales en adressant un Ac monoclonal modifié. Thérapeutique Techniques Question 17 à un enzyme capable dactiver des prodrogues (3) Utilisation dAc monoclonaux modifiés couplés: à une toxine bactérienne ou végétale (1) à un isotope radioactif (2) Ac = Vecteur dacheminement des substances vers les cellules tumorales Différentes actions possibles : - Bloque signal de survie - Bloque signal de prolifération - Induit lapoptose (3) (1) (2)

31 Les perspectives de demain … Aujourdhui : 28 anticorps monoclonaux à la disposition des patients (le 1 er a été mis sur le marché en 1986) 250 anticorps monoclonaux en développement Quel avenir pour limmunothérapie ? Anticorps monoclonaux : vers traitement pour toutes les pathologies ? IgA : un anticorps plus efficace et plus localisé que IgG ? Perspectives

32 Merci de votre attention !!


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