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Immunodéficiences - généralités Immunodéficiences primaires : maladies héritées, un ou plusieurs composés du système immuniyaire Immunodéficiences secondaires.

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1 Immunodéficiences - généralités Immunodéficiences primaires : maladies héritées, un ou plusieurs composés du système immuniyaire Immunodéficiences secondaires : cause externe : Irradiation, malnutrition, médicaments, infections Cellules concernées : lymphocytes T, B, phagocytes, complément Conséquences : Déficiences B : infections chroniques ou répétées (streptocoques, staphyllocoques, etc./ pneumonies, otites, sinusites Déficiences T : infection par virus, fungi/ déficiences humorales

2 I. X-linked infantile (Bruton s) agammaglobulinemia (1cas/ ), après 5-6 mois, infections bactériennes Survie: ans; dépression ou absence complète de toutes les classes d immunoglobulines; pas de maturation de cellules pré-B; gène tyrosine kinase cytoplasmique (btk)? Cellules T fonctionnent normalement II. Déficiences sélective d immunoglobulines IgA (1/700) ; infections sinupulmonaires ou sans symptomes IgG2, IgG4, infections pyogéniques IgM (Hyper -M syndrome) déficience en IgG et IgA, beaucoup IgM Autoanticorps anti-IgM; pas de switch; déficientes en CD40 ligand III. Common variable immunofeficiency (CVID) Apparaît à ans, suite à une infection EBV; déficience IgA Lymphomes IV. Transient hypogammaglobunemia (enfance) 5-6 mois, pendant 3 ans ; IgM normaux, pas de switch ( lymphokines) Déficiences d anticorps et de cellules B

3 Déficiences de cellules T et immunodéficiences combinées I. Severe Combined Immunodefiency Disease SCID Héterogène, manque de cellules souches à la diff. en B et T Peu de lymphocytes dans le sang; susceptibilité à toute infection Diarrhées, pneumonies, fatal sans traitement. - Plus de 50% lié au chr. X, chaîne d interleukines ; - Déficience adénosine déaminase ADA -accum.dATP Greffe de moelle osseuse. II. Congenital thymic aplasia (DiGearge Syndrome) Pas de développment de thymus et glandes parathyroides Pas de lymphos T ; b présent mais pas de IgG Greffe de thymus III. Ataxia-telangiectasia Abonormalités immunologiques, neurologiques,; def. T, IgA, IgG2, IgG4

4 THERAPIE GENIQUE Principes vecteurs viraux (par ex. adénovirus) vecteurs synthétiques (par ex. lipides cationiques) vecteurs synthétiques (par ex. lipides cationiques) vecteurs viraux (par ex. adénovirus) ADN EXPRESSION DE GÈNES

5 Vecteur Rétrovirus Adenovirus Adeno-ass. Virus Herpes simplex Vuris type I ADN nu Liposomes Caractéristiques de vecteurs de transfert de gènes Avantages 1-30 % transduction, Permanent; HSC, C épithéliales Cellules éipithéliales; Haute fréquence Stable ; division cellulaire Pas nécessaire; intègre dans génome ; faible fréqu. Diff. Types cellulaires Expression prolongée Simple Simple; Inconvénients Instable ; faible titre viral Limite : 9-12 kb Pas de HSC; immunogène Limite 5kb, faible titre viral Pas d intégration dans Génome; cytotoxique Faible intégration Faible fréquence

6 PRINCIPE : TRANSFERT DE GENES Efficacité in vitro (gènes/cellule) concentration (gènes/ml) Taille du gène (kbp) > 150 immunogène transitoire

7 Protocole pour une thérapie génique pour souris rag -/- 5 Souris rag-2 -/- Extraction de HSC du fémur Réaction C-kit Ab Monoclonal avec mélanine Vecteur gène rag-2 Marquage HSC Par c-kit monoclonal FEL 6.1 m 130mW/mm2 30 sec 9 Souris rag-2 -/- Injection de cellules irradiés dans veine

8 c is an essential component of the receptors for IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 and IL-15. Mutation of c results in XSCID Abbreviations: c, common cytokine receptor chain; IL, interleukin; XSCID, X-linked severe combined immunodeficiency disease. SCID

9 T-B+NK- SCID can be caused by mutations (as depicted by the cross) in c or Jak3 (a), whereas T-B+NK+ SCID can be caused by mutations in the gene encoding IL-7R (as depicted by the cross) combined immunodeficiency disease;

10 Cellules B Cellules pré-pro-B Common lymphoid Precursor (CLP) HSC Ikaros PU.1 Cellules pré-pro-B précoces Cellules pré-pro-B tardives Cellules pré-B Pré-BR Pax5 EA2 Pax5 NK GATA3 Notch1 CD44+ CD25- NK DC Id3 Il-15 CD44+ CD25+ EA2 Notch? Id3 Il-7 CD44- CD25+ HEB Notch1 T CD8 ? IL-7 Il-7R+ EPO-R-

11 Thérapie génique pour X-SCID Modèle souris : c -/-; transduction de c (murin et humain)- rétrovirus Cellules T, B, NK Chez l homme : Cellules CD34+ transfectées avec c (vecteur: rétrovirus : virus de la leucémie murine moloney) Patients : 8 et 11 ans, détection c par PCR. Thérapie génique pour ADA Administration bi-hebdomadaire de PEG-ADA(bovine) Cellules T transfectées avec gène ADA CD34+ transfectées avec gène ADA Problème : efficacité de transfection (1-2% ) Solution : CD34+/CD38- + flt3-L + trombopoiétine (TPO) 50% avec vecteur rétroviral

12 Successful transfer of ADA gene in vitro into human peripheral blood CD34+ cells by transfecting EBV-based episomal vectors, FEBS Letters, Volume 441, Issue 1, 11 December 1998, Pages Etsuko Satoh, Hideyo Hirai, Tohru Inaba, Chihiro Shimazaki, Masao Nakagawa, Jiro Imanishi and Osam Mazda

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14 ADA activity of the transfected cells. PB CD34+ cells were transfected with pSES.ADA (open squares in A and C), pSES.CD8(closed circles in A and C), or indicated plasmids (in B). Cells cultured for 3 days (A and B) or pooled CFU-c colonies derived from the transfected cells (C) were lysed and ADA enzyme activities were assayed as described.

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16 Live attenuated or killed vaccines - polio, rabies Subunit (antigen) vaccines - tetanus, diptheria Conjugate vaccines - Haemophilus influenza Synthetic (recombinant) - Hepatitis (H.B. surface ag purified from yeast) Viral vectored - trial canarypox for HIV DNA vaccines - numerous clinical trials (passive immunization and adjuvants) Vaccine Types

17 Nouvelles approches vaccinales Les vaccins sous-unités Les vaccins vivants recombinés La vaccination par DNA nu Les vaccins T-dépendants Les vaccins thérapeutiques

18 HAT IS CURRENTLY GOING ON WITH ANTI-HIV VACCINE DEVELOPMENT? Current strategies 1. Live attenuated vaccines based on deletion of non-essential NEF gene in monkeys Effective against highly pathogenic strains of SIV. Because of the problems with reversion : vaccine strains with multiple NEF deletions. But : disease in juvenile monkeys and adult monkeys. Although the Australian cohort remained free of disease for more than 17years (7.5 with SIV) evidence that they too are losing CD4+ T cells. 2. Whole killed virus vaccine is again being studied The problem remains, however, that failure in inactivation : a retrovirus that has the potential to integrate into the host genome and cause disease at a much later time. 3. Recombinant subunits of the envelope and core do induce high levels of neutralizing antibody but poor cross neutralization and there are no killer T cells to attack infected cells. 4. Peptide epitopes directed against the principal neutralizing domain of HIV gp Pseudovirus may be used to make vaccines. One could insert a gene for the env protein into the genome of a harmles virus. These live vectors that can induce antibody and killer T cells. 6. DNA immunization--a safe, inexpensive, transportable. Gives both humoral and cell-mediated immunity. Naked DNA vaccines have already been effective against SIV.

19 Live attenuated virus vaccines

20 La fonction de NEF « Negative Regulating Factor » Downregulation de CD4 et du CMH Transcription réverse plus efficace Live attenuated virus vaccines

21 In vivo, HIV can infect a resting T cell but cannot replicate in that cell. Although NEF can activate the cell, it cannot be made in the resting T cell. The above observations solve this conundrum. Macrophages are infected by HIV and make NEF without any activation process. As a result they make factors that activate resting T cells that can now support a productive infection! Live attenuated virus vaccines - NEF Résultat HIV avec nef déficient : inhibe développement du SIDA (Rhésus) Risque : réversion en forme virulente

22 Making a genetic vaccine: from Genetic Vaccines: Scientific American, 1999 by David B. Weiner and Ronald C. Kennedy La vaccination par DNA nu muqueuses

23 La vaccination par DNA nu - Principe du ELI (Expression Library Immunization) Génome du pathogène Fragments ADN pathogène Plasmide banque Animaux Groupe1 Groupe2 Groupe3 Groupe4 Groupe5 Groupe6 Etc…. Résistant sensible Isolation du plasmide Analyse du plasmide Vaccin

24 La vaccination par DNA nu - exemples Antigène viral hôte voie réponse protection HIV-1env, gag, pol chimpanzé I.M. Ab et CTL oui HIV-1 nef, rev, tat homme I.M. CTL N/A HIV-1 env et rev homme I.M. Ab et CTL N/A HIV-1 env ADN+prot rhésus I.M. Ab, TH, CTL oui Ebola np et gp souris/c.inde I.M. Ab et CTL partielle Sendai virus souris gene gun CTL partielle Influenza np souris I.M. Ab et CTL oui Influenza A HA porc muq. Ab non Malaria circumsporozoite ag souris I.M. CTL, cytok. NO partielle Malaria gene + prot souirs I.M. CMI oui

25 Les vaccins vivants recombinés Souches virales ou bactériennes atténuées utilisées comme vecteur pour l ADN du pathogène : Bactéries : bacille Calmette-Guerin (BCG;HIV ENV, SIV Gag; immun systémique et muqueuse) Listeria monocytogenes (muqueuses souris) Salmonellae (vaccin oral souris; transfection de phagocytes ; réponse. Cell. et humorale)) Shigella (intranasal ; b-gal) Virus : Vacinia virus Ankara (MVA ; HIV env + injection Il-2) Canarypox (gp 160, gp 120, gag, pol, env, nef; réponse CTL à HIV-1) Coxackivirus (immunogène et non pathogène; Coxacki-HIV recomb.)

26 (a) Salmonella stimulates membrane ruffling and macropinocytosis, which results in uptake of this organism by professional phagocyte]. (b) Entry into the host cell also induces apoptosis. (c) Membrane blebs, which contain the DNA vaccine, are released by the Salmonella-infected cells undergoing apoptosis and are phagocytosed by proximal bystander dendritic cells (DC), resulting in delivery of the DNA vaccine to the DC. The antigen encoded by the DNA vaccine is then expressed by the DC and presented in the context of major histocompatibility complex (MHC) class I and class II to CD8+ and CD4+ T cells, respectively. Proposed model for the delivery of DNA vaccines by Salmonella Les vaccins vivants recombinés

27 BCG remains in an early phagosome and prevents fusion with the lysosome, whereas Salmonellae promote the development of a spacious phagolysosome after fusion with the primary lysosome. L. monocytogenes and Shigellae, on the other hand, lyse the phagosome and enter the cytoplasm of the host cell. The intracellular tropism of bacille Calmette-Guerin (BCG), Listeria monocytogenes, Salmonellae and Shigellae vectors

28 Les vaccins T- dépendants Des méthodes pour générer des Ag peptidiques à la place des Ag polysaccharides L hypothèse de Jerne sur le réseau idiotypique - Par anticorps anti-idiotypique - Par phage display - ADN nu


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