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Principe de de la résonance plasmonique de surface Lorsqu'un faisceau de lumière polarisée monochromatique illumine une interface entre deux milieux d'indice.

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1 Principe de de la résonance plasmonique de surface Lorsqu'un faisceau de lumière polarisée monochromatique illumine une interface entre deux milieux d'indice de réfraction différent, une partie de la lumière incidente est réfléchie sur l'interface et l'autre partie de la lumière est réfractée à travers la surface. Plaque de verre Air Liquide Lumière polarisée monochromatique Lumière réfléchie Lumière réfractée

2 Air Liquide Lumière polarisée monochromatique Lumière réfléchie Selon l'angle d'incidence du faisceau toute la lumière peut être réfléchie. Lorsqu'il n'y a pas de réfraction, une des composantes électromagnétiques de la lumière, l'onde évanescente, se propage perpendiculairement à l'interface sur une distance équivalente à sa longueur d'onde. Principe (suite) Onde évanescente

3 Si une couche fine de métal, riche en électrons libres est déposée à l'interface, ceux-ci entrent en résonance avec les photons du faisceau incident, ce phénomène est appelé résonance plasmonique de surface. Une conséquence énergétique de cette résonance est visible dans le faisceau réfléchi qui, analysé avec une barrette de diodes présente une chute d'intensité à un angle défini. Cet angle d'intensité minimum est l'angle de résonance. Il varie en fonction de l'indice de réfraction du milieu présent dans le champ évanescent. Principe (suite) Air Liquide Lumière polarisée monochromatique Lumière réfléchie Onde évanescente i Plaque de verre Film dor Barette de diodes I

4 Le Biacore a pour fonction de visualiser en temps réel des interactions entre biomolécules non marquées dans un débit continu de tampon. Principe de fonctionnement du Biacore Un des réactifs, le ligand, est retenu de manière spécifique sur une interface appelée sensor chip (biocapteur).

5 L'analyte dilué dans un tampon circule à flux constant à la surface du biocapteur. Les changements de masse induits par l'association ou la dissociation des complexes modifient la réfringence du milieu et décalent la position de l'angle de résonance. L'enregistrement de la variation de l'angle de résonance permet de suivre en temps réel la fixation des molécules injectées sur le biocapteur. Le signal de résonance est exprimé en unités de résonance (RU). L'enregistrement de ce signal s'appelle un sensorgramme. Le sensorgramme.

6 Le cycle danalyse en temps réel Ligand

7 Le cycle danalyse Analyte

8 Le cycle danalyse Phase dassociation

9 Le cycle danalyse Analyte + Ligand Complexe

10 Phase de dissociation Le cycle danalyse Tampon

11 Analyse Mathématique Le cycle danalyse Analyse cinétique de La liaison analyte - ligand

12 Le cycle danalyse Phase de régénération Agent régénérant

13 Interactions en Temps Réel par BIACORE Applications majeures Constantes daffinités (K D = M) et cinétiques (k a, k d ) Concentration active dun analyte Cartographie épitopique Validation de molécules recombinantes Détection de molécules (milieux complexes) Etude paramétrique Micropurification et récupération Molécules concernées protéines, acides nucléiques, sucres, lipides, petites molécules, drogues, peptides cellules, particules virales...

14 Nature Biotechnology 21, (2003) Rational design of a CD4 mimic that inhibits HIV-1 entry and exposes cryptic neutralization epitopes Loïc Martin 1, François Stricher 1, Dorothée Missé 2, Francesca Sironi 3, Martine Pugnière 4, Philippe Barthe 5, Rafael Prado-Gotor 5, Isabelle Freulon 1, Xavier Magne 2, Christian Roumestand 5, André Ménez 1, Paolo Lusso 3, Francisco Veas 2 & Claudio Vita 1

15 MiniCD4 protéine mimétique (3kD) faite par synthèse peptidique à partir dun fragment de toxine de scorpion donnant les caractéristiques structurales du CD4 Objectifs de l étude Etude des interactions entre gp120 et miniCD4 Démontrer que miniCD4 peut démasquer des épitopes neutralisants de la gp120 rec. et sur la gp120 native BIACORE Interaction protéine-virus : HIV Martin L, Stricher F, Misse D, Sironi F, Pugnière M, Barthe P, Prado-Gotor R, Freulon I, Magne x, Roumestand C,Menez A, Lusso P, Veas F and Vita C. (2003). Nat Biotechnol 21(1): 71-6

16 STRUCTURE DU VIH intégrase enveloppe RT gp120 gp41 ARN P17 (matrice) P24 (capside) P7 (nucléocapside) core protéase 90 à 120 nm

17 HIV Lifecycle Rambaut A. et al. Nat. Rev. Genet. 5:52-61, 2004

18 Entrée du virus dans la cellule : 1 re étape du cycle de réplication virale Cellules infectées ou exprimant des protéines de lenveloppe virale Glycoprotéines de lenveloppe CCR5 ou CXCR4 (corécepteur) Interaction entre le complexe trimérique de lenveloppe et le récepteur CD4 modification conformationnelle de la gp120 et de la gp41 augmentation de 100 à fois de laffinité pour le corécepteur VIH CD4 Cellules cibles exprimant CD4 et corécepteur CROI Daprès E. Hunter, Birmingham, abstract 118, actualisé 1

19 Les différentes étapes déclenchant la fusion - Daprès E. Hunter, Birmingham, abstract 118, actualisé Attachement cellulaire non spécifique Fixation au récepteur CD4 Initiation de la modification conformationnelle de lenveloppe Fixation au corécepteur Fin de la modification conformationnelle de lenveloppe Formation dune structure en épingle à cheveux, hélicoïdale avec rapprochement des membranes Initiation de la fusion des membranes lipidiques 1. Inhibition de la fixation au CD4 2. Inhibition de la fixation au corécepteur 3. Inhibition de la modification conformationnelle de la gp41 (fusion) gp120 gp41 CD4 Corécepteur Étapes possibles du blocage de lentrée Cellule cible Virus 2

20 Structure of HIV-1 gp120/CD4 Complex CD4 gp120 Blue: glycosylation sites

21 STRATEGIES ANTI-VIH : bloquer les étapes Inhibiteurs de la fusion Inhibiteurs de la RT Inhibiteurs de lintégrase Inhibiteurs de lassemblage Analogues nucléosidiques Non nucléosidiques Inhibiteurs de la transcription ARNm ARN viral gp120 CD4 ADN proviral ADN intégré Rétro Transcriptase protéines Inhibiteurs de protéase GC/VIH/99

22 Synthétiser une mini proteine qui mime CD4 et qui inhibe lentrée de HIV dans la Cellule

23 interaction : gp120 sur CD4M33 immobilisé Les gp120 se lient au CD4M33 Interaction protéine-virus :HIV Interactions Moléculaires en Temps Réel (M. Pugnière, F. Roquet) CNRS-UMR 5160 site CRLCC Val dAurelle

24 Le CD4M33 induit les changements de conformation de la gp120 HXB2 soluble ou de la gp120 portée par les particules virales nécessaires pour exposer les épitopes du 48D et du 17B. + CD4s ou M33 - CD4 ou +M0 gp120WT-CD4 / 48D Part. virales+CD4 / 48D +M33 Interaction protéine-virus :HIV

25 --Elles amènent une quantification de laffinité mais surtout des données cinétiques. -Etude des interactions à plus de deux partenaires -Etude paramétrique de ces interactions -Méthode applicable à grand nombre de molécules et aux interactions complexes -Récupération possible Conclusions


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