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La PCR Applications en santé animale (aperçu) Voir lADN : lélectrophorèse But de la PCR Comment ça marche? Comment procéder? Quelques exemples Julie Lavoie,

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1 La PCR Applications en santé animale (aperçu) Voir lADN : lélectrophorèse But de la PCR Comment ça marche? Comment procéder? Quelques exemples Julie Lavoie, enseignante au Collège Lionel-Groulx

2 PCR : de nombreuses applications en santé animale Diagnostic de maladies infectieuses Détection dallèles récessifs chez des hétérozygotes Génotypage danimaux de laboratoire Sexage animal Tests de filiation

3 Voir lADN : lélectrophorèse LADN : observation directe impossible Y accrocher des molécules* qui silluminent aux UV Grande quantité dADN… mais quel ADN?

4 *Des molécules qui saccrochent à lADN et qui silluminent aux UV : –Le bromure déthydium (EtBr) –Le Vistra Green –Le SYBR Green Ces produits doivent être utilisés avec des précautions extrêmes (on sait notamment que le bromure déthydium est un mutagène extrêmement puissant) Électrophorèse – animation : Pour accéder au site, cliquez ICI ou lien sur page web EDC.cliquez ICI Sur le site, choisir successivement : 1-Manipulation 2-Techniques 3-Sorting and sequencing 4-Gel electrophoresis : animation 2D

5 But de la technique PCR Amplifier un segment dADN dintérêt** afin de pouvoir le visualiser (en électrophorèse)

6 **Des segments dADN dintérêt (1/3) : Pour dépister un agent infectieux, amplifier un segment spécifique au génome du pathogène recherché, par ex.: virus (ex.: ADN du Coronavirus entérique félin « PIF ») bactéries (ex.: ADN de Chlamydia) parasites (ex.: ADN du Ver du cœur canin) Pour déceler un allèle récessif, amplifier un segment spécifique à lallèle récessif causant la maladie, par ex.: ex.: Syndrome du porc stressé « PSS » Suite…

7 **Des segments dADN dintérêt (2/3) : Pour tester le génotype dun animal de laboratoire, amplifier un segments correspondant à la particularité génétique à contrôler pour cet animal, par ex.: Un gène inactivé (knock-out) ou un gène ajouté dans un animal transgénique Pour sexer un animal, amplifier des segments spécifiques aux chromosomes sexuels, donc : Des gènes situés uniquement sur le chromosome X, sur le Y, sur le Z ou sur le W Suite…

8 **Des segments dADN dintérêt (3/3) : Pour établir la parenté (ex.: test de paternité) ou lidentité dun individu (ex.: domaine judiciaire), amplifier plusieurs segments dADN non codant très polymorphes (hypervariables) entre individus, par exemple les microsatellites. Pour chacun de ces segments, chaque individu possède deux allèles parmi des dizaines possibles. Le résultat densemble est donc unique pour chaque individu.

9 Imite « in vitro » la réplication de lADN***, mais seulement pour un segment dADN bien précis On utilise une enzyme, la Taq polymérase, qui est une ADN polymérase thermorésistante ; (cette enzyme a été isolée chez une bactérie vivant dans les sources thermales du Parc Yellowstone!) PCR : polymerase chain reaction ou ACP : amplification en chaîne par la polymérase La PCR : comment ça marche? (1/3)

10 ***La réplication de lADN « in vivo » (rappel) : Les nucléotides « libres » sunissent aux brins dADN «exposés», par complémentarité de leurs bases azotées : (A – T ) (C – G) Le travail (ouverture de la double hélice, assemblage des nucléotides ajoutés et fermeture des deux doubles hélices) est effectué par une équipe denzymes dont lADN polymérase. Réf. pour plus de détails : Lien/animation et Tortora et al. (2002) p. 137Lien/animation

11 Lensemble des ingrédients est mis dans un microtube : –Extrait dADN –Amorces (« primers ») spécifiques à la région à amplifier –Taq polymérase et tampon de réaction –dNTP (nucléotides, portant les bases A, C, G et T) –H 2 O stérile TOUT doit être fait pour éviter de contaminer les échantillons à analyser : stérilité du matériel et des solutions, travail en asepsie, etc. La PCR : comment ça marche? (2/3)

12 Le microtube est mis dans un thermocycleur (machine à PCR) et subit une série de cycles au cours desquels la température varie. Animation : Liens vers une autre animation sur la PCR : voir Médiagraphie ou page web EDCMédiagraphie La PCR : comment ça marche? (3/3)

13 La PCR : comment procéder? (1/2) 1°) Prélevement dun échantillon contenant de lADN : Recherche dun pathogène dans un animal malade ou mort : prélèvement sanguin ou de viscères, car lADN du pathogène peut être détecté dans les tissus de lanimal (sang, foie, cerveau)… Analyse des gènes de lanimal (pour déterminer son sexe, son espèce, ses allèles…) : prélèvement sanguin, cutané (buccal), de poils ou de plumes, ou même parfois ses fèces (excréments). *Important : Bien identifier léchantillon et indiquer quel test est à effectuer, car les amorces diffèrent pour chaque test.

14 2°) Extraction dADN à partir de léchantillon Après cette étape, le microtube dextrait contient tout lADN contenu dans léchantillon : celui de lanimal tout comme celui des pathogènes présents dans les tissus prélevés. 3°) Amplification par PCR Après cette étape, le microtube à PCR contient des millions de copies du segment dADN recherché, celui auxquelles les amorces utilisées sont spécifiques. 4°) Visualisation des résultats par électrophorèse 5°) Interprétation du résultat La PCR : comment procéder? (2/2)

15 Exemple : Sexage doiseaux De gauche à droite : Puits #1 = un standard, donc un mélange de fragments dADN de tailles connues, utilisés comme repères pour déterminer la taille des fragments obtenus par PCR Les puits #2 et 3 =ADN de deux individus de sexe… Les puits #4 à 7 = ADN de quatre individus de sexe…

16 Médiagraphie Sources des images : Thermocycleur : Modèle moléculaire de lADN : Gel - sexage doiseaux : Électrophorèse aux UV : Réplication de lADN : Sites pertinents : Informations sur différents tests PCR disponibles en santé animale : Lien vers lanimation sur la PCR : Lien vers 3 images « fixes » tirées de lanimation précédente, avec courts textes : Lien vers une autre animation sur la PCR : une fois sur le site, choisir : Manipulation ; Techniques ; Amplifying Dans le même site est disponible également une animation sur le séquençage (dont la réaction est très semblable à celle de la PCR). Il est donc intéressant de comparer les deux dans ce même site. Lien vers une animation sur la réplication de lADN « in vivo » et les enzymes impliquées :


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