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Applications de marqueurs immunotoxicologiques en écotoxicologie.

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1 Applications de marqueurs immunotoxicologiques en écotoxicologie

2 PLAN Survol historique Considérations toxicologiques Approches en immunotoxicologie Conckusions

3 SURVOL HISTORIQUE 1884La phagocytose 1890Les anticorps 1901Les groupes sanguins Les bases cellulaires de limmunité Les bases moléculaires de limmunité 1975Limmunopharmacologie 1980Limmunotoxicologie · cibles (1983) · résistance(1985)

4 Réponse immunitaire non- spécifique Réponse immunitaire spécifique Prolifération lymphoblastique Présentation de lAg Réactions inflammatoires Phagocytose Activité cytotoxique Y Y Sécrétion danticorps Y Réponse immunitaire cellulaire Réponse immunitaire humorale Tc B B B B B B B BB Th NK

5 Réponse immunitaire non- spécifique Réponse immunitaire spécifique Prolifération lymphoblastique Présentation de lAg Réactions inflammatoires Phagocytose Activité cytotoxique Y Y Sécrétion danticorps Y Réponse immunitaire cellulaire Réponse immunitaire humorale Tc B B B B B B B BB Th NK Phénotypage

6 CONSIDÉRATIONS TOXICOLOGIQUES Santé humaine ? Santé des écosystèmes ? ASPECTS RÉGLEMENTAIRES

7 CONSIDÉRATIONS TOXICOLOGIQUES 1. Fiabilité et reproductibilité des méthodes 2. Sensibilité des paramètres sélectionnés 3. Allure de la courbe dose-réponse

8 1. FIABILITÉ ET REPRODUCTIBILITÉ DES MÉTHODES

9 PROGRAMME INTERNATIONAL D HARMONISATION PROTOCOLE 10 laboratoires d Europe et des États-Unis Rat Réponse humorale par la technique des plages de lyse (PFC) Azathioprine composé modèle Résultats exprimés en pourcentage de la réponse du laboratoire de référence

10 Réponse immunitaire non- spécifique Réponse immunitaire spécifique Prolifération lymphoblastique Présentation de lAg Réactions inflammatoires Phagocytose Activité cytotoxique Y Y Sécrétion danticorps Y Réponse immunitaire cellulaire Réponse immunitaire humorale Tc B B B B B B B BB Th NK

11 GRM Complément Splénocytes Chambre de Cunningham PRINCIPE DES PFC

12 PROGRAMME INTERNATIONAL DHARMONISATION (Réponse humorale) Lab Lab Dose 1 Dose 2 Dose 3 % LAB. RÉFÉRENCE

13 2. SENSIBILITÉ DES PARAMÈTRES SÉLECTIONNÉS

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16 x10-91x10-81x10-71x10-61x10-51x10-4 Concentrations (M) Index de phagocytose HgCl2 ZnCl2 CH3HgCl CdCl2 EFFET DES MÉTAUX LOURDS SUR LA PHAGOCYTOSE DES COELOMOCYTES CHEZ LE VER DE TERRE CdCl2

17 CI 50DOSE ANALYSE DES RÉSULTATS CI % réponse normale

18 IMMUNOTOXICITÉ COMPARATIVE DES MÉTAUX CHEZ LE VER DE TERRE (CI 50) ZnCl 2 CdCl 2 HgCl 2 CH 3 HgCl > 10 x M 3.0 x M 1.8 x M 0.03 x M

19 3. ALLURE DE LA COURBE DOSE- RÉPONSE

20 Dose 1: NOEL; 2: dose de référence; 3:dose 50 % ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE Effet Adulte 2 1 3

21 Dose Effet AdulteEmbryon : NOEL embryon; 2: dose de référence; 3: NOEL adulte; 4: dose 50% ALLURE DE LA COURBE DOSE-RÉPONSE

22 APPROCHES 1.MODÈLES CLASSIQUES 2.IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON

23 APPROCHES 1.MODÈLES CLASSIQUES 2.IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON

24 PROTOCOLE NON TRAITÉ VEHICULE DIELDRIN 1, 4, 7, 10, 14, 28, 42 DAYS TESTS IMMUNOLOGIQUES MACROPHAGES B LYMPHOCYTES T LYMPHOCYTES

25 EFFETS DE LA DIELDRINE SUR LES CELLULES PRODUCTRICES D ANTICORPS % Réponse normale Dose (LD50) 1/32 1/16 1/8 1/4 1/2

26 IMMUNOTOXICITÉ DE LA DIELDRINE MACROPHAGES B LYMPHOCYTES T LYMPHOCYTES PHAGOCYTOSE FLAMBÉE OXIDATIVE PROCESSING DE L ANTIGÈNE PFC LPS Ab CON A PHA MLR GVH

27 NON TRAITÉ VEHICULE DIELDRINE PROTOCOLE MODÈLE DE RESISTANCE MURINE HEPATITIS VIRUS 3 Salmonella typhimurium

28 RESISTANCE AUX INFECTIONS ANTI BACTERIENNE ANTI VIRALE S. typhymurium MHV 3 MORTALITÉ BACTÉRICIDIE PHAGOCYTOSE ANTICORPS MORTALITÉ ANTICORPS EFFETS CYTOPATIQUES RÉPLICATION

29 TOXIQUES Chlorure de mercure Chlorure de méthyl mercure Chloride de cadmium Chlorure de zinc DDT, DDE BPC congenères 138, 153, 168, 180 Benzo-a-pyrene TCDD Mélanges (synthétiues, effluents, sédiments) insecticides herbicides

30 RELATIONS TOXIQUE ET SYSTÈME IMMUNITAIRE X AUTOIMMUNITÉ SOI MODIFIÉ SOI SUSCEPTIBILITÉ AUGMENTÉE * INFECTIONS * CANCERS IMMUNOSUPPRESSION SYSTÈME IMMUNITAIRE ALLERGIESELIMINATION RÉPONSE IMMUNITAIRE ANTI-X NON-SOI

31 IMMUNO COMPÉTENCE? CANCERS INFECTIONS CONTAMINANTS

32 APPROCHES 1.MODÈLES CLASSIQUES 2.IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN

33 LISTE DES ESPÈCES Mye Moule Mactre Choquemort Plie Truite Chien Chat Poulet Aigle Caille Écureuil Rat Souris Ver de terre Phoque Béluga Ours polaire Cochon Bœuf Bœuf musqué Lama Élan Cheval Chèvre Mouton Alligator Grenouille

34 SENSIBILITÉ DES ESPÈCES HgCl 2 CI50 (x ) Choquemort0.08 Truite0.13 Mye0.48 Bœuf musqué1.09 Bœuf1.24 Lama1.29 Aigle1.40 Élan1.43 Mouton1.70 Ver de terre1.80 Poulet1.90 Cochon10.08 Rat10.20 Humain

35 Mercury concentrations (M) % Normal response (SI x 100) CH 3 HgCl HgCl 2 Mercury concentrations (M) % Normal response (SI x 100) CH 3 HgCl HgCl 2

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37 APPROCHES 1.MODÈLES CLASSIQUES 2.IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON

38 PROCÉDURE EXPÉRIMENTALE ZnCl 2 10 ug/l 50 ug/l CdCl 2 1 ug/l 5 ug/l Hg/Zn 0,3/30 ug/l 0,5/50 ug/l Cd/Zn 3/30 ug/l 5/50 ug/l CH 3 HgCl 0,1 ug/l 0,5 ug/l UN METAL Cd/Hg 3/0,3 ug/l 5/0,5 ug/l DEUX METAUX Cd/Hg/Zn 3/0,3/30 ug/l 5/0,5/50 ug/l TROIS METAUX Truite arc-en-ciel 30 jours d exposition

39 PARAMÈTRES oxidative burst cytométrie phagocytose cytométrie macrophage PHALPS ConA prolifération H 3 -thymidine lymphocyte lysozyme activité colorimétrie IgM ELISA serum Rein

40 CHLORURE DE CADMIUM Phago.Oxid.ConAPHALPSLyso.IgM % réponse du témoin 1ug/l 5 ug/l * * *

41 CHLORURE DE MERCURE Phago.Oxid.ConAPHALPS Lyso. IgM % réponse du témoin 0.1 ug/l 0.5 ug/l * * * * * * * * *

42

43 CADMIUM / MERCURE % réponse du témoin Phago.Oxid.ConAPHALPSLyso.IgM 3/ 0.3 ug/l 5/ 0.5 ug/l *

44 CADMIUM / ZINC Phago.Oxid.ConAPHALPSLyso.IgM % réponse du témoinl 3/30 ug/l 5/50 ug/l *

45 MERCURE / ZINC % réponse du témoin Phago.Oxid.ConAPHALPSLyso.IgM 0.3/30 ug/l 0.5/50 ug/l * *

46 CADMIUM / MERCURE / ZINC % réponse du témoin Phago.Oxid.ConAPHALPS Lyso. IgM 3/0.3/ 30 ug/l 5/0.5 /50 ug/l * * * * * nd *** *

47 APPROCHES 1.MODÈLES CLASSIQUES 2.IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON

48 Facteurs confondants Nombre dindividus Âges Sexe Sites

49 Nombre Nombre dindividus % Variation

50 SITE % phagocytes/rein Ma Me Hu Lac

51 Variations mensuelles % Phagocytes/rein Juil Sept Oct Mois

52 Variations liées au sexe % Phagocytes/rein M M M Ma Me Hu Lac F F F

53 SENSIBILITÉ AU MERCURE

54 Apopka Woodruff Con A ug cpm x 1000 Transformation blastique

55 Venise en QcSt-AmableBouchervilleChibouetFairbanks Site d'échantillonnage Nombre de phagocytes actifs ( x 10 6 ) A B B BC C Phagocytose de splénocytes de Rana pipiens juvéniles capturées en juillet

56 Phagocytose de splénocytes de Rana pipiens juvéniles capturées en septembre Venise en QcSt-AmableBouchervilleChibouetFairbanks Site d'échantillonnage Nombre de phagocytes actifs ( x 10 6 ) A B B BC C

57 APPROCHES 1.MODÈLES CLASSIQUES 2.IN VITRO 3. EXPOSITIONS CONTRÔLÉES EN LABORATOIRE 4. TERRAIN 5. COMBINAISON

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59 * : μg/g sédiment sec BPC* ,3,4,4- T 4 CB ,3,4,34- P 5 CB ,4,5,3,4- P 5 CB ,3,4,4,5- P 5 CB230202,3 3,3,4,4,5- H 6 CB3,20,50,1 BPC dans les sédiments de la Baie-des-Anglais

60 Métaux* Pb23,6518,6316,75 Cd0,200,090,06 Ag0,070,04- Cu18,9018,039,12 Hg0,080,030,01 * : μg/g sédiment sec Métaux dans les sédiments de la Baie-des-Anglais Sites

61 Produits de combustion ( μg/g sédiment sec) Sites HAP dans les sédiments de la Baie-des-Anglais

62 Site 1, 2, 3 Site semaines Protocole expérimental

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64 Effets de l exposition in situ CellsMO 1+ MO 3+ Nombre de cellules (107) Site 3 Site 2 Site 1

65 Protocole expérimental Site 1 sédimentSable 1, 2, 3 mois et recouvrement immunologie, analyse chimique

66 Nombre de macrophages actifs mois 2 mois3 mois Récupération Nombre de cellules (107) Témoin Exposé

67 Pathologies Neoplasies % Pneumonies (vers) % Infections bactériennes1315.3% Malformations 5 5.9% Parasitisme 4 4.7% Infections (virus, autres) 6 7.1% Non déterminées1821.1% Autres causes 910.5% 85 nécropsies de 235 carcasses ( )

68 Tumeurs décrites Adenocarcinomes: intestin, estomac, utérus, glandes salivaires, glandes mammaires Carcinome de la vessie Lymphosarcome thymique Tumeurs de lovaire (granulosa, dysgerminoma) Hépatocarcinome

69 Développement des outils et étude des paramètres immunitaires à partir déchantillons de sang de bélugas en captivité Validation des méthodes et établissement dune banque de données à partir des animaux de larctique Étude de la sensibilité aux xénobiotiques par des expositions in vitro Étude chez les rongeurs (gras de béluga dans la diète) Caractérisation des animaux du Saint-Laurent Programme de recherche

70 Lymphocytes de bélugas et DDE

71 Lymphocytes de bélugas et DDT

72 Expositions in vitro Métaux : Pb, Cd, Hg, Ag, Zn, Cu TCDD, DDT, DDE Congénères de BPC Insecticides, herbicides Mélanges

73 Programme de recherche Développement des outils et étude des paramètres immunitaires à partir déchantillons de sang de bélugas en captivité Validation des méthodes et établissement dune banque de données à partir des animaux de larctique Étude de la sensibilité aux xénobiotiques par des expositions in vitro Étude chez les rongeurs (gras de béluga dans la diète) Caractérisation des animaux du Saint-Laurent

74 Diète pour 90 jours - Gras de bœuf - Huile de maïs % béluga Saint-Laurent ou Arviat - mélange 75:25, 50:50, 25:75 Compétence immunitaire Phagocytose, transformation blastique, phénotypage, NK, PFC Protocole expérimental

75 Boeuf75/25 25/ St % N.R. * * * * PFC * Maïs50/50100

76 Sexe et maturation Hémolymphe Estradiol Testostérone Progestérone Sérotonine PgE 2, PgF 2 Phagocytose

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78 x10-91x10-81x10-71x10-61x10-51x10-41x10-3 CONCENTRATIONS ( M ) EFFETS SUR LA PHAGOCYTOSE SUITE À DES EXPOSITIONS IN-VITRO CH 3 HgCl HgCl 2 CdCl 2 ZnCl 2 AgNO 3 Brousseau et et al., Toxicology 142 :

79 CMFDA CMF Conjugaison des thiols Non conjugué Esterase DA CMF-SH PRINCIPE DE LA MESURE DES THIOLS

80 Effet de la NEM sur la fluorescence induite par la CMFDA Dose de NEM (ug/ml) Fluorescence moyenne

81 EFFET DU MERCURE SUR LE NIVEAU INTRACELLULAIRE DE THIOLS CHEZ LA MYE Concentrations (M) Intensité de fluorescence (FL1)

82 Estradiol Testostérone Progestérone Sérotonine PgE 2, PgF 2 Sexe et maturation Phagocytose 0 5

83 Témoin N = X N = 15 [TBT] = 5 µg.L -1 [Atrazine] = 8 µg.L -1 [Diuron] = 0.07 µg.L -1 [E2] = M X N = 15 [TBT] = 50 µg.L -1 [Atrazine] = 80 µg.L -1 [Diuron] = 0.7 µg.L X N = 15 [TBT] = 500 µg.L -1 [Atrazine] = 800 µg.L -1 [Diuron] = 7 µg.L -1 [E2] = M Protocole expérimental

84 débimètre Contaminants 0.2 ml/min. Eau de mer 200 ml/min. Mytilus edulis Filtre Mya arenaria Expositions In vivo

85

86 Charge tissulaire ug/g Corrélation entre lexposition et la charge tissulaire (14j.) Dose Molaire CH 3 HgCL HgCl 2

87 Charge tissulaire ug/g Corrélation entre la charge tissulaire et l inhibition de la phagocytose Phagocytose %

88 Blanc - Sablon Havre-St-Pierre Carleton Gaspé Grande - Rivière Havre-aux-Maisons

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90 CONCLUSIONS Xénobiotiques Espèces labo. SI Espèces fauniques In vitro In vivo In vitro In vivo Expositions contrôlées (résistance) Expositions contrôlées Terrain 1.

91 CONCLUSIONS Mécanismes d immunotoxicité LaboratoireTerrain 2.

92 CONCLUSIONS 3. Biomarqueurs immunologiques en écotoxicologie Validation Espèces laboratoire Espèces fauniques Utilisation Suivi environnemental d espèces fauniques

93 CONCLUSIONS 4. Biomarqueurs immunologiques en santé humaine Validation Etude clinique Utilisation Suivi environnemental

94 Exposition Fonctions cellulaires Altérations physiologiques Santé de lindividu Communauté Population Écosystème Impact éclogique croissant Échelle de temps Réponses moléculaires et cellulaires

95 % de population Résistance au pathogène Malades mais vont survivre Ne survivront pas Pathologie légère Présence dAb


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