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REGULATION DE lAMPkinase Fabrizio Andreelli CHU Bichat et INSERM U 695.

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2 REGULATION DE lAMPkinase Fabrizio Andreelli CHU Bichat et INSERM U 695

3 Lénergie…cest la vie !!

4 Lipogenèse (nourri) Lipolyse (à jeun)

5 TG alimentaires AGL TG AGL + glycérol

6 Au moins deux phénomènes Résistance à linsuline Altération de linsulinosécrétion

7 Un phénotype stéréotypé… Production hépatique de glucose Stéatose hépatique Insulinorésistance Lipolyse accrue Insulinorésistance AGL Glycérol

8 C.Tour de taille J Vague 1947

9 Lipotoxicité et TAV TG AGL Stéatose Muscle Cellule AGL insulinorésistance insulinosécrétion

10 Nature 2006 Relations TAV et NASH

11 Greco AV et al. Diabetes 2002 Dépôts lipidiques extra-adipocytaires: muscle

12 Dépôts lipidiques extra-adipocytaires: foie

13 Jia MD et al, Diabetes 2000 Dépôts lipidiques extra-adipocytaires: beta cell Rat OLEFT

14 Cancello R et al. Diabetes 2005

15 Miyazaki Y et al. AJP 2002

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18 Syndrome métabolique

19 Tour de taille mesuré En position debout et en expiration douce A mi-hauteur entre rebord costal inférieur rebord costal inférieur crête iliaque crête iliaque daprès Lean (1995) Risque élevé Risque 102 cm 102 cm 94 cm 94 cmHomme 88 cm 88 cm 80 cm 80 cmFemme Obésité - répartition

20 Conséquences du syndrome métabolique InsulinorésistanceDiabète de type 2 Sd métabolique Risque cardio-vasculaire

21 Intra-abdominal adiposity and glucose metabolism Pouliot et al 1992 IAA: intra-abdominal adiposity Significantly different from 1 non-obese, 2 obese with low intra-abdominal adiposity levels Time (min) , mmol/L , ,2 1 Area 1,2 Area pmol/L InsulinGlucose Non-obese Obese low IAA Obese high IAA

22 AGL Tissu adipeux abdominal

23 AMPKinase Changements métaboliques Effets enzymatiques Effets géniques Environnement hormonal

24 regulatory SU catalytic SU Structure de l'AMP-kinase

25 1, 2 1, 2 1, 2, 3 1, 2, 3 N488IR531G T400NH383R R302Q R225Q mutation 3 mutations 2 1, 2 1, 2 AMPK Catalytic domain binding N C N C NC Glycogen binding AMP/ATP binding CBS1 CBS2 AMPK kinase CBS3 CBS4 Thr172 Catalytic subunit Regulatory subunit Structure of AMP-activated protein kinase LKB1 CaMKK

26 AMP is signal of energy depletion fatty acid oxidation fatty acid synthesis

27 ATP Adenylate kinase ADP ATP physical exercise ischemia hypoxia AMP AMP AMP ATP ADP LKB1 CaMKK CaMKK Pi H2OH2O Phosphatases AMP AMPK ATP ATP-generation ADP ATP-consuming = -AMPK Regulation of AMP-activated protein kinase glucose deprivation metabolic poisons AMP/ATP AMP/ATP

28 Regulation of AMP-activated protein kinase CBS 4 T172 CBS 4 AMPKK AMP : Catalytic subunit : Scaffold/glycogen-binding : Regulatory (AMP-binding) AMP ATP AMP ATP P LKB1 CaMKK inactive AMPK active AMPK

29 Insuline P IRS-1 PI-3 kinase Glucose Glucose Glut4 Ox Stockage AMPK + AICAR

30 Bergeron R et al. AJP 1999

31 Bergeron R et al. Diabetes 2001

32 Le traitement de rongeur par AICAR -augmente la captation intramusculaire de glucose même en présence dune insulinorésistance *rongeur sain *rongeur obèse

33 Winder WW. J Appl Physiol 2001

34 Mu J et al. Mol Cell 2001

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36 Mu J et al. 2003

37 La réduction spécifique de lactivité de lAMPK dans les muscles -sassocie à une diminution de la captation de glucose contraction dépendante -réduit la synthèse de glycogène -altère sa re-synthèse post-exercice physique -naltère pas la signalisation de linsuline musculaire -naltère pas la sensibilité à linsuline in vivo ni la glycémie

38 Les mutations activatrices des sous-unités de lAMPK entraînent une accumulation de glycogène intramusculaire (muscle squelettique 3 et cœur 2) et participent à la physiopathologie des syndromes de pré-excitation cardiaque (WPW).

39 Arad M et al. Circulation 2003

40 Lactivation de lAMPK musculaire par la contraction ou lAICAR augmente la synthèse de glycogène musculaire Les mutations activatrices de lAMPK dans le muscle ou le cœur provoquent laccumulation de glycogène et favorisent des troubles de conduction

41 Le traitement de rongeur par AICAR -augmente la captation intramusculaire de glucose -réduit la production hépatique de glucose et la stéatose hépatique *rongeur sain *rongeur obèse

42 Bergeron R et al. Diabetes 2001

43 Zhou G et al. J Clin Invest 2001

44 FFA Acyl-CoA Malonyl-CoA Acétyl-CoA CPT-1 -Oxydation -Oxydation Acétyl-CoAGlucoseGlucose-6P Pyruvate Citrate Krebs FFA Acétyl-CoA carboxylase (ACC) AMPK Metformine + -

45 Lactivation pharmacologique de lAMPK -augmente la captation intramusculaire de glucose -réduit la production hépatique de glucose -réduit la lipogenèse hépatique *rongeur sain *rongeur obèse Intérêt thérapeutique dans le diabète de type 2 !!

46 AMPK 1-/- AMPK 2-/- Phenotypic analysis of AMPK KO mice AMPK 1-/- AMPK 2-/- KO is embryonic lethal

47 LoxP + CRE Recombinase Activity in vitro - without DNA replication - without topo activity - without cofactors + CRE + CRE = Recombinase from bactériophage P1 Recombinase from bactériophage P1 LoxP = 34bp sequence DNA Cre-loxP Strategy

48 x mice harbouring a complete inactivation of 2 CRE EIIA promoter ( zygote) Total inactivation of 2 AMPK

49 muscle liver +/+-/- +/+-/- 1 KO 1 KO +/+-/-+/+-/- muscle liver 2 KO 2 KO AMPK 1 AMPK 2 Characterization of AMPK KO mice 2 wt 2 ko +/-+/+-/- +/-+/+ 1 wt 1 ko -/- AMPK 1 AMPK 2 Western blot Southern blot Western blot Southern blot Jorgensen, JBC2004 Viollet, JCI2003

50 E9.5 dpc Control 1-/- 2-/- Alive no morphological differences E11.5 dpc Dead morphological aspect of E KO -> embryonic lethality around 10.5 dpc. AMPK complexes play an essential role during embryonic development.

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52 AMPK 2-/- mice are not obese body weight (g) +/+-/- Body weight %of fat mass +/+-/- % of fat mass Food intake (g/d)) +/+-/- Food intake F Andreelli, J Clin Invest 2001

53 Glucose tolerance test in AMPK KO mice time (min) glucose (mg/dl) AMPK 1-/- control 1 KO 1 KO time (min) * ** * glucose (mg/dl) 2 KO 2 KO control AMPK 2-/- +/+ -/- 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0 0,1 0,2 0,3 * +/+ -/- Insulinemia at 20min (ng:ml) Insulinemia F Andreelli, J Clin Invest 2001

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55 Glucose TOHGPGlycolysisGln Synthesis control AMPK 2 -/- ** ** Metabolic parameters during euglycemic hyperinsulinemic clamp in AMPK 2-/- mice F Andreelli, J Clin Invest 2001

56 control AMPK 2-/ Gln synthesis ** 0 0,25 0,5 Total Gln content * Muscle glycogen during clamp in AMPK 2-/- mice F Andreelli, J Clin Invest 2001

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58 In vitro glucose transport in AMPK 2-/- muscle Deoxyglucose transport (µmol/g/h) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 basalinsulin +/+ Soleus 0 0,5 1 1,5 EDL basalinsulin -/- Deoxyglucose transport (µmol/g/h) +/+ -/- +/+ -/- +/+ -/- F Andreelli, J Clin Invest 2001

59 Insulin content per islet is similar: ng/islet (AMPK 2-/-) versus ng/islet (control) In vitro glucose-stimulated insulin secretion F Andreelli, J Clin Invest 2001

60 AMPK 2-/- mice do not present: - hypokaliemia - hyperleptinemia - increased TG content in pancreas Why are AMPK 2-/- mice insulinopenic? modification of sympathetic and parasympathetic balance activity?

61 Urinary catecholamine levels in AMPK 2-/- mice ** urinary epinephrine (ng/d) * urinary dopamine (ng/d) ** urinary norepinephrine (µg/d) epinephrinenorepinephrinedopamine +/+ -/- +/+ -/- +/+ -/- F Andreelli, J Clin Invest 2001

62 -adrenergic antagonist treatment of AMPK 2-/-mice F Andreelli, J Clin Invest 2001

63 use of AMPK-DN mice expressing a dominant inhibitory mutant of AMPK in skeletal muscle. use of AMPK-DN mice expressing a dominant inhibitory mutant of AMPK in skeletal muscle. (Mu et al., 2001) Is impaired glycogen synthesis linked to the lack of AMPK activity in skeletal muscle? creatine kinase promoter AMPK-DN

64 Glucose tolerance test time (min) Glucose tolerance in AMPK-DN mice 60 AMPK-DN serum glucose (mg/dl) control

65 Alpha 2-AMPK KO mice are insulin resistant --> In vivo insulin stimulated glycogen synthesis is reduced AMPK DN muscle + - Glycogen synthesis rate ng/min.mg Control + 0 Insulin AMPK KO Alpha * Insulin resistance is not due to lack of muscle AMPK

66 Altered regulation of metabolism in AMPK 2-/- mice glucose insulin high sympathetic tone glycogen synthesis catecholamine insulin F Andreelli, J Clin Invest 2001

67 Rôle essentiel de la sous-unité alpha 2 dans les actions métaboliques de lAMPK.

68 Diabetes 2004

69 La délétion de la sous-unité alpha 2 de lAMPK dans tous les tissus altère la sensibilité à linsuline et prédispose à lobésité. Intérêt en génétique humaine ?

70 Quid de leffet tissu-spécifique de lAMPK ? KO alpha 2 spécifique du foie

71 Liver 2 KO AMPK 1 AMPK 2 WT liver 2 CRE Albumin promoter 2flox x Liver 2 KO wt deleted floxed fl/fl; cre- liver+/+; cre+ liverfl/fl; cre+ liver fl/fl; cre+ pancreasfl/fl; cre+ hypothalamus fl/fl; cre+ adipose tissue fl/fl; cre+ muscle fl/fl; cre+ liver Andreelli F et al, Endocrinology 2006

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73 Régulation hormonale de la PHG Insuline Adiponectine Leptine Néoglucogenèse - -

74 Table adiponectine Andreelli F et al, Endocrinology 2006 Pas de conséquence sur la signalisation de linsuline Perte du contrôle de la PHG par la leptine et ladiponectine

75 AMPKalpha 2 LeptineAdiponectine + Néoglucogenèse Insuline

76 Surexpression de lAMPkinase

77 Adenovirus injection pfu Sacrifice 48h infection Expression of AMPK 2-CA by in vivo adenovirus- mediated gene transfer in mice Adenovirus AMPK 2-CA + analysis of gene expression in fasted/refed conditions effect on glycemia Diabetes 2005

78 -> injection of adenovirus expressing constitutively active AMPK in control and diabetic mouse models CA-AMPK §§ Blood Glucose (mg/dl) fasted glucose §§ wt ob/ob § 300 STZ Relative mRNA Level §§ § PEPCK mRNA wtob/obSTZ Liver AMPK targeting is sufficient to control glycemia in diabetic mice. Ad -gal Ad CA-AMPK Diabetes 2005

79 FFA Acyl-CoA Malonyl-CoA Acétyl-CoA CPT-1 -Oxydation -Oxydation Acétyl-CoAGlucoseGlucose-6P Pyruvate Citrate Krebs FFA Acétyl-CoA carboxylase (ACC) AMPK LeptineAdiponectineMetformineTZDs + -

80 Patti ME, Kahn BB. Nature Medicine 2004

81 Rôle essentiel de la sous-unité alpha 2 de lAMPK dans les actions métaboliques. Rôle de la SU alpha 1 ?

82 AMPK 1 KO mice are anemic RBC (10 6 /ml) *** +/+-/ /-+/+ Ht (%) *** /-+/+ Hb (g/dl) *** Hb (g/dl) +/+ -/ RBC (10 6 /ml) -/- +/+ 1 KO 1 KO 2 KO 2 KO /-+/+ Ht (%)

83 *** iron (µg/g) +/+-/- Splenomegaly in AMPK 1 KO mice control AMPK 1-/-

84 Expression of AMPK 1 isoform in RBC AMPK 1 AMPK 2 control 1-/- 2-/- Exclusive expression of AMPK 1 isoform in RBC = specific role for AMPK 1 in RBC integrity.

85 ATP utilization in RBC Glucose phosphorylation Phosphorylation of membrane proteins Ionic pumps ATP * ATP content in AMPK 1 -/- RBC +/+-/-

86 brain AMPK Liver muscle heart red blood cells adipose tissue hepatic glucose production fatty acid metabolism cardiac ischemia glucose transport glycogen synthesis lipolysis food intake insulin sensitivity ion transport AMPK 2 AMPK 1

87 Institut Cochin, Paris Viollet Benoit Marc Foretz Myriam Bennoun Claire Cheret Axel Kahn Sophie Vaulont Copenhagen Muscle Research Center University of Toulouse Christophe Perrin Rémy Burcelin Sebastian B. Jørgensen Jørgen F.P. Wojtaszewski Erik A. Richter Howard Hughes Medical Institute Morris J. Birnbaum James Mu

88 Les Thiazolidinediones Moller DE et al, Int J Obes 2003 Wilson TM et al, Ann Rev Biochem 2001


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