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COMPARTIMENTS DE LA CELLULE ET TRI DES PROTÉINES.

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1 COMPARTIMENTS DE LA CELLULE ET TRI DES PROTÉINES

2 II - Transport entre noyau et cytosol

3 3 Schéma du routage

4 4 Enveloppe nucléaire Définit le compartiment nucléaire Comporte deux membranes Traversée par des complexes de pores

5 5 Membrane nucléaire interne En continuité avec la membrane externe Composition en protéines spécifiques Sites de liaison –de la chromatine –de la lamina nucléaire

6 6 Membrane nucléaire externe En continuité avec la membrane interne En continuité avec le RE Porte des ribosomes Composition en protéines spécifiques

7 7 Espace périnucléaire En continuité avec la lumière du RE

8 8 Fig 12-9 Enveloppe nucléaire

9 9 Trafic entre cytosol et noyau Bidirectionnel Cytosol noyau (sélectif) –Histones –ADN polymérase –ARN polymérase –protéines de régulation des gènes –protéines de maturation de l'ARN… Noyau cytosol (sélectif) –ARNt –ARNm Cytosol noyau cytosol –protéines ribosomales…

10 10 Wente,SR2000 Science Fig. 1. The NPC at increasing structural resolution. Over the past 50 years, a series of EM studies have resolved the structural features of the vertebrate and yeast NPCs at an increasingly Þne level. Illustrations based on representative structures are presented from different points in time. The models are shown in section perpendicular to the nuclear envelope and are reproduced from those in the original publications [reproduced from (4) by copyright permission of Academic Press and from (10), (66), and (67) by copyright permission of The Rockefeller University Press] (A) Afzelius 1955 (B) EM studies by Unwin and Milligan resolved the structure of NPCs in Xenopus oocyte nuclear envelopes (C) In 1993, Akey and Radermacher reported the three-dimensional reconstruction of Xenopus NPCs resolved by cryo-EM technology (D) Rout and colleagues mapped the relative surface accessible locations of the yeast S. cerevisiae Nups on the yeast NPC structure by immunoEM (10). Each circle represents a Nup position with green for symmetrical FG Nups, blue for strictly nuclear FG Nups, red for strictly cytoplasmic Nups, gray for non-FG Nups, and purple and purple stripes for different integral membrane proteins associated with the NPC

11 11 Les complexes de pore Masse molaire de 125 millions Plus de 50 protéines différentes appelées nucléoporines Symétrie octogonale

12 12 Cronshaw,JM2002p915Table3J CB Nucléoporines

13 13 Fig 12-10AB (A) Complexe de pore –colonne –composant annulaire –composant luminal –composant en bague (deux) –fibrilles cytosoliques –fibrilles nucléaires panier nucléaire –protéines nucléaires = protéines cytosoliques sauf pour les fibrilles (B) MEB face nucléaire (ovocyte)

14 14 Fig 12-10CD (C) Coupe fine de ME : continuité des membranes externe et interne (D) Coloration négative en ME après élimination de la membrane par détergent

15 15 (B) MEB face nucléaire (ovocyte) Fig B

16 16 Schéma complexe de pore 3 ème édition Fig

17 17 Intensité du trafic dans un complexe de pore Plus le noyau transcrit plus il y a de complexes de pore En général entre 3000 et 4000 par noyau Pendant la réplication de l'ADN il faut 10 6 molécules d'histone toutes les 3 minutes il passe 100 molécules d'histone toutes les minutes dans un pore S'il y a transcription en plus, il faut 6 nouvelles grosses et petites sous-unités ribosomales par minute

18 18 Diffusion à travers le complexe de pore Si PM < D passage libre Si PM = D 2 minutes pour s'équilibrer entre noyau et cytosol Si PM > D n'entre pas dans le noyau Présence d'un canal aqueux de 9 nm de diamètre et 15 nm de long

19 19 Wente,SR2000 Science

20 20 Fig Voies possibles de diffusion libre à travers le complexe de pore –Taille estimée à partir d'expériences de diffusion = 9 nm : –Très inférieure aux mesures effectuées en ME –Des particules de 26 nm peuvent passer activement par dilatation du pore () –Perte de composants pendant la préparation ?

21 21 Spécificité du passage Les ribosomes cytosoliques matures (30 nm) ne reviennent pas dans le noyau Les nouveaux ribosomes sortent du noyau ADN et ARN polymérases (PM = à D) peuvent entrer dans le noyau

22 22 Signaux de localisation nucléaire (SLN) Des protéines nucléaires introduites dans le cytosol retournent dans le noyau Signaux de localisation nucléaire (SLN) –présents uniquement sur les protéines nucléaires –soit séquences signal soit signaux patch –séquences riches en acides aminés + (Arg ou Lys) pouvant être n'importe où dans la protéine extrémité chaîne latérale…

23 23 Fig Signal de localisation nucléaire –antigène T du virus SV40

24 24 Fig Visualisation du transport actif à travers les pores nucléaires –Sphères d'or colloïdal recouvertes de signaux de localisation nucléaire –Injection dans la cellule vivante

25 25 Fig ème édition Nucléoplasmine

26 26 Fig ème édition Localisation de la nucléoplasmine en ME

27 27 Passage à travers le complexe de pore L'orifice peut s'ouvrir jusqu'à un diamètre de 26 nm Il semble y avoir un diaphragme qui s'ouvre pour laisser passer le substrat Le passage se fait à travers le canal aqueux (très différent de la translocation à travers une membrane La protéine peut garder sa conformation 3D

28 28 Les récepteurs d'importation nucléaire Les signaux de localisation nucléaire doivent être reconnus par des récepteurs d'importation nucléaire Codés par une famille de gènes proches Chaque membre de la famille code pour un récepteur spécialisé dans le transport d'un groupe de protéines nucléaires proches

29 29 Fig 12-14A Les récepteurs d'importation nucléaire –Les protéines cargo 1, 2 et 3 comportent des signaux de localisation nucléaire différents ce qui les conduit à se lier à un récepteur d'importation nucléaire différent

30 30 Les récepteurs d'importation nucléaire Protéines solubles cytosoliques Se lient aux nucléoporines et au signal de localisation nucléaire de la protéine cargo Certaines nucléoporines forment les bras des fibrilles cytosoliques Les nucléoporines sont riches en répétition FG (phénylalanine/Glycine) qui servent de site de liaison aux récepteurs d'importation Puis suivent leur chemin jusqu'au complexe de pore en suivant les répétitions FG

31 31 Fig 12-14B Protéines adaptateur entre récepteur d'importation nucléaire et protéine nucléaire –Structure proche du récepteur d'importation nucléaire (eg : Kap et Kap )

32 32 Les récepteurs d'exportation nucléaire Servent à l'exportation des protéines du noyau vers le cytosol –Sous-unités ribosomales –Molécules d'ARN Reposent sur des signaux d'exportation nucléaire portés par les macromolécules à exporter Se lient au signal et aux nucléoporines Codés par la même famille que les récepteurs d'importation nucléaire

33 33 Les récepteurs de transport nucléaire = caryophérines (eg : Kap ) Famille de gènes Dont la famille s'appelle importine Comportent les –récepteurs d'importation nucléaire –récepteurs d'exportation nucléaire 14 gènes chez la levure

34 34 Chook,YM2001p703 (Table1) Protéines de la famille Kap

35 35 Système de transport cytosol noyau Même système pour importation et exportation mais dans deux sens opposés Le récepteur d'importation transporte le cargo dans le noyau puis est reexporté dans le cytosol où il est réutilisé Le récepteur d'exportation transporte le cargo dans le cytosol puis est reimporté dans le noyau où il est réutilisé Un pore peut transporter dans les deux sens

36 36 Augmentation de l'ordre dans la cellule Il y a des protéines spécifiques du noyau Il y a des protéines spécifiques du cytosol Donc il y a accroissement de l'ordre dans la cellule Donc il faut de l'énergie Elle résulte de l'hydrolyse de GTP en GDP par une GTPase appelée Ran

37 37 Ran GTPase monomérique Hydrolyse GTP en GDP + énergie Fournit l'énergie pour l'importation et l'exportation nucléaires Existe dans le cytosol et le noyau Existe dans deux conformations suivant que c'est du GTP ou du GDP qui est lié

38 38 Protéines régulatrices de Ran Activent la conversion de Ran en Ran GTP ou Ran GDP Deux types de protéines régulatrices de Ran –1 - GTPase Activating Protéine (GAP) Active Ran GTP Ran GDP Cytosolique Le cytosol contient du Ran GDP –2 - Guanine Exchange Factor (GEF) Échange GDP en GTP Transforme Ran GDP Ran GTP Nucléaire Le noyau contient du Ran GTP

39 39 Fig Guanine Exchange Factor (GEF) est dans le noyau attaché à la chromatine Ran GTP est dans le noyau GTPase Activating Protéine (GAP) est dans le cytosol Ran GDP est dans le cytosol

40 40 Fig C'est le gradient des deux conformations différentes Ran GTP/Ran GDP qui détermine la bonne direction du transport nucléaire

41 41 A - Importation

42 42 Fig gauche C'est le gradient des deux conformations différentes Ran GTP/Ran GDP qui détermine la bonne direction du transport nucléaire

43 43 Les deux éléments qui déterminent la bonne direction de l'importation Le déplacement des récepteurs d'importation nucléaire le long d'alignements de répétition de FG des nucléoporines jusqu'au bord nucléaire du complexe de pore ne peut se faire que s'ils sont chargés du bon cargo La liaison du Ran GTP (qui est localisé dans le noyau) entraîne la libération du cargo de son récepteur

44 44 Fig 12-17A Récepteur dimportation nucléaire –Hélices –Sites de liaison des protéines cargo et du Ran GTP

45 45 Fig 12-17B Cycle de chargement dans le cytosol et déchargement dans le noyau d'un récepteur d'importation nuclaire

46 46 Devenir du récepteur d'importation nucléaire - Ran GTP Le cargo a été libéré dans le noyau Retourne dans le cytosol par le complexe de pore "Ran binding protein" (NTF2) déplace Ran GTP du récepteur Ran-GAP peut activer Ran qui hydrolyse son GTP lié Ran-GDP quitte "Ran binding protein" Ran-GDP est réimporté dans le noyau

47 47 Les trois points de vue 1 - Le Ran 2 - Le cargo 3 - Le récepteur d'importation

48 Le Ran

49 Le cargo

50 Le récepteur d'importation

51 51 Chook,YM2001p703 (fig1) Caryophérine (Kap ) se complexe à Caryophérine1 (Kap 1) pour fixer Ran GTP ARM = motifs retrouvés chez la drosophile comme équivalent de caténine chez l'homme

52 52 Chook,YM200 1p703 (fig2) Structures des complexes –Kap et –Kap -NLS (Signal de localisation nucléaire)

53 53 Chook,YM2001 p703 (fig3) Structures des complexes Kap

54 54 Chook,YM2001p 703 (fig4) Modèle d'un complexe d'importation nucléaire NLS*-Kap-Kap 1 fixé aux répétitions FG d'une nucléoporine *NLS = Nuclear Localization Signal

55 55 B - Exportation : idem importation : toutefois Ran GTP dans le noyau entraîne la liaison du cargo à son récepteur (au lieu de la dissociation dans l'importation) puis Liaison au complexe de pore (nucléoporines) Passage dans le cytosol, Action de ran binding protein et ran GAP, Hydrolyse du GTP, Libération du cargo et ran GDP dans le cytosol, Le récepteur d'exportation retourne dans le noyau.

56 56 Fig droite C'est le gradient des deux conformations différentes Ran GTP/Ran GDP qui détermine la bonne direction du transport nucléaire

57 57 Localisation des protéines Protéines qui font la navette entre noyau et cytosol importation nucléaire > exportation localisation nucléaire exportation nucléaire > importation localisation cytosolique possibilité de changer la localisation d'une protéine en agissant sur les taux relatifs d'importation et d'exportation Protéines fixes dont le passage à travers le pore est strictement contrôlé Régulation de la localisation nucléaire régulation de l'expression des gènes

58 58 4 exemples Embryon de drosophile Activation des lymphocytes T Métabolisme du cholestérol Régulation de l'expression des gènes par récepteur des glucocorticoïdes

59 59 Fig Embryon de drosophile Protéine régulatrice du gène dorsal exprimée dans toutes les cellules de l'embryon gène actif que dans les cellules ventrales (en bas) où elle a une localisation nucléaire

60 60 Fig Activation des lymphocytes T NF-AT = Nuclear Factor of Activated T cells Protéine régulatrice de gène cytosolique phosphorylée au repos Cyclosporine inhibe la calcineurine pas de déphosphorylation

61 Métabolisme du cholestérol Les protéines régulatrices de gène cytosoliques sont liées à des protéines inhibitrices qui –soit les immobilisent dans le cytosol –soit masquent leur signal de localisation nucléaire (SLN) pas de liaison possible avec le récepteur d'importation nucléaire Protéine du métabolisme du cholestérol –forme inactive dans la membrane du RE –si carence en cholestérol activation de protéases qui libèrent la protéine de la membrane du RE –la protéine peut entrer dans le noyau et activer les gènes de la synthèse du cholestérol

62 62 Fig ème édition 4 - Régulation de l'expression des gènes par récepteur des glucocorticoïdes

63 63 Exportation des ARN Les nouveaux messagers sont liés à des protéines même pendant leur maturation nucléaire Ces protéines ont des signaux d'exportation nucléaire Une fois dans le cytosol ces protéines sont retirées et retournent dans le noyau Les ARN immatures sont retenus dans le noyau

64 64 Enveloppe nucléaire Lamina nucléaire Filaments intermédiaires Lamines nucléaires Réseau à deux dimensions

65 65 Fig La lamina nucléaire (ovocyte de xenopus)

66 66 Burke,B2002p487(fig1) Topologie de l'enveloppe nucléaire

67 67 Burke,B2002p575(fig1)Nat Rev Mol Cell Biol Organisation de l'enveloppe nucléaire

68 68 Rapports de la lamina nucléaire Complexes de pores Protéines intégrales de la membrane nucléaire interne Chromatine Liens entre ADN et enveloppe nucléaire

69 69 Pai,CY2002p452TI CB

70 70 Hegele,RA2000 Nat Med

71 71 Pathologie de la lamina nucléaire Dystrophie musculaire de Emery- Dreifuss liée à l'X et autosomique dominant Lipodystrophie de Dunnigan

72 72 Brian C. Capell & Francis S. Collins Human laminopathies: nuclei gone genetically awry Nature Reviews Genetics 7, (December 2006) Fig1 The nuclear lamina lies on the inner surface of the inner nuclear membrane (INM), where it serves to maintain nuclear stability, organize chromatin and bind nuclear pore complexes (NPCs) and a steadily growing list of nuclear envelope proteins (purple) and transcription factors (pink). Nuclear envelope proteins that are bound to the lamina include nesprin, emerin, lamina-associated proteins 1 and 2 (LAP1 and LAP2), the lamin B receptor (LBR) and MAN1. Transcription factors that bind to the lamina include the retinoblastoma transcriptional regulator (RB), germ cell-less (GCL), sterol response element binding protein (SREBP1), FOS and MOK2. Barrier to autointegration factor (BAF) is a chromatin-associated protein that also binds to the nuclear lamina and several of the aforementioned nuclear envelope proteins. Heterochromatin protein 1 (HP1) binds both chromatin and the LBR. ONM, outer nuclear membrane.

73 73 Brian C. Capell & Francis S. Collins Human laminopathies: nuclei gone genetically awry Nature Reviews Genetics 7, (December 2006) Fig 2 The LMNA gene (introns not to scale) is 57.6 kb long and consists of 12 exons, encoding two globular domains and a central -helical coiled-coil rod domain. Lamin C (not shown) is encoded by exons 1 to 9 and a portion of exon 10. Lamin A results from alternative splicing, which adds exons 11 and 12 and removes the lamin-C-specific portion of exon 10. Examples of the main mutations that cause laminopathies are shown above the gene; not all mutations are listed. A more complete list can be obtained at the Leiden Muscular Dystrophy pages and OMIM. In the case of HGPS, MAD, FPLD, AR-EDMD, RD and CMT2B1, the most common causative LMNA mutation (or only mutation) is shown. In the cases of AD-EDMD, AWS, LGMD1B, GLD and DCM1A, a representative mutation among multiple causative mutations is included. AD-EDMD, autosomal dominant Emery–Dreifuss muscular dystrophy; AR-EDMD, autosomal recessive Emery–Dreifuss muscular dystrophy; AWS, atypical Werner syndrome; CMT2B1, Charcot– Marie–Tooth disorder, type 2B1; DCM1A, dilated cardiomyopathy, type 1A; FPLD, Dunnigan familial partial lipodystrophy; GLD, generalized lipodystrophy; HGPS, Hutchinson–Gilford progeria syndrome; LGMD1B, limb girdle muscular dystrophy, type 1B; MAD, mandibuloacral dysplasia; RD, restrictive dermopathy.Leiden Muscular Dystrophy pagesOMIM

74 74 Brian C. Capell & Francis S. Collins Human laminopathies: nuclei gone genetically awry Nature Reviews Genetics 7, (December 2006) Fig 3

75 75 Enveloppe nucléaire pendant la mitose (1 de 2) Phosphorylation des lamines nucléaires par une cdk (kinase dépendant des cyclines) Désassemblage des complexes de pore Les protéines de membrane diffusent dans le RE Mélange des protéines nucléaires et cytosoliques

76 76 Enveloppe nucléaire pendant la mitose (2 de 2) L'enveloppe se reforme autour des chromosomes Le RE s'enroule autour des chromosomes Puis fusionne Les complexes se reforment et réimportent les protéines nucléaires (qui ont gardé leur signal de localisation) De ce fait toutes les protéines nucléaires sont réimportées

77 77 Burke,B2002p487( fig2) Cellules de rein de rat ADN, Microtubules, enveloppe nucléaire (POM 121) a - Liséré nucléaire b - Invaginations de l'enveloppe nucléaire c - Enveloppe nucléaire fragmentée d - Enveloppe nucléaire dispersée e - Enveloppe nucléaire partiellement reconstituée Interphase Prophase Prométaphase Métaphase Anaphase Cytodiérèse

78 78 Burke,B200 2p487(fig3) Fragmentation de l'enveloppe nucléaire –a Interphase (nucléation de MT par les centosomes) –b Prophase : invagination de l'enveloppe –c Déchirement de l'enveloppe –d Prométaphase : Le trou s'aggrandit –e Métaphase : les MT retirent les résidus d'enveloppe vers les centrosomes

79 79 Beaudouin, J2002p83fi g7Cell Désorganisation de l'enveloppe nucléaire

80 80 Burke,B2002p 487(fig4) Deux modèles d'assemblage des pores nucléaires

81 81 Burke,B2002p48 7(fig5) Les étapes de l'assemblage de l'enveloppe nucléaire

82 82 Fig Fragmentation et reformation de l'enveloppe nucléaire pendant la mitose

83 83 Cartier,R2002p157GeneTher Application thérapeutiques des signaux de localisation nucléaires


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