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1 Le nucléosome ADN et chromosomes. 2 Plan I - Structure et fonction de l'ADN II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre chromatinienne –organisation.

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1 1 Le nucléosome ADN et chromosomes

2 2 Plan I - Structure et fonction de l'ADN II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre chromatinienne –organisation des gènes le long de la molécule d'ADN III - Structure globale des chromosomes –emballage de la molécule d'ADN dans les chromosomes

3 3 II - ADN chromosomique et emballage dans la fibre chromatinienne 1 - Le chromosome 2 - Organisation des gènes sur le chromosome 3 - Cycle du chromosome 4 - Séquences nécessaires et suffisantes pour se dupliquer et passer d'une génération à l'autre 5 - Emballage de l'ADN 6 - Régulation de lactivité de la chromatine

4 4 1 - Le chromosome L'ADN est divisé en chromosomes Génome = 3,2 milliards de paires de nucléotides 24 chromosomes différents 1 chromosome = 1 molécule d'ADN + protéines ADN + protéines = chromatine

5 5 Chromatine (Walter Flemming 1882) ADN + protéines Décrit par Flemming (1882) Colorable

6 6 Walter Flemming ( ) Cytologiste allemand connu pour avoir décrit le premier la division cellulaire appelée mitose. Également le premier à décrire les chromosomes. Études de médecine et de zoologie jusquen 1868 dans plusieurs universités allemandes. Thèse sur les muscles ciliaires Assistant, puis professeur S'installe définitivement à Kiel comme professeur d'anatomie et directeur de l'institut d'anatomie, jusqu'à sa retraite en 1901.

7 7 Walter Flemming ( ) Vers le milieu du XIXe siècle, la connaissance de la division cellulaire était limitée par la faible qualité des lentilles des microscopes et des méthodes de coloration. Certains scientifiques pensaient qu'il s'agissait d'une division directe, mais d'autres postulaient l'existence de phases intermédiaires pendant lesquelles le noyau « père » se dissociait avant de reconstituer deux noyaux fils. Walter Flemming est le premier à décrire, dans son ouvrage Zellsubstanz, Kern, Zelltheilung, publié en 1882, les différentes phases de la division cellulaire.

8 8 Walter Flemming : Les différentes phases de la division cellulaire A cette occasion, il forge les mots mitose, chromatine, plan équatorial et achromatine. Il est également un des premiers cytologistes à décrire les chromosomes pendant la division cellulaire, sans pour autant expliquer leur rôle Il remarque la constance de leur nombre pour une espèce donnée.

9 9 Walter Flemming : autres travaux Amélioration de certains fixateurs et colorants cellulaires Description de l'amitose, division cellulaire directe par étranglement du corps cellulaire et du noyau, phénomène qu'il considère toutefois, de façon erronée, comme pathologique.

10 10 Protéines de la chromatine Emballage de l'ADN Régulation de l'expression des gènes Réplication et réparation de l'ADN

11 11 Chromosome bactérien Une seule molécule d'ADN circulaire Protéines d'emballage différentes Mal connu

12 12 Les chromosomes eucaryotes Chaque cellule a deux copies de chaque chromosome –une héritée du père et –une héritée de la mère Chromosomes homologues Exception : chromosomes sexuels chez le mâle –Y hérité du père –X hérité de la mère

13 13 Jeux chromosomiques Homme : 22 paires d'autosomes + X + Y Femme : 22 paires d'autosomes + X + X Homme : 46,XY Femmes : 46,XX

14 14 Mise en évidence des chromosomes Hybridation Colorants

15 15 Fig 4-10 Hybridation de chromosomes humains masculins Caryotype spectral (peinture chromosomique)

16 16 Fig 4-11 Chromosomes humains masculins Coloration au Giemsa –chaque chromosome a un marquage longitudinal spécifique qui permet de le reconnaître

17 17 Caryotype Affichage des 46 chromosomes à la mitose Mise en évidence des anomalies

18 18 Caryotype féminin normal

19 19 Fig 4-12 Anomalie chromosomique –(A) Coloration au Giemsa –(B) Peinture chromosomique 4124 Nt Nt

20 Organisation des gènes sur le chromosome Un gène –protéine –ARN

21 21 Complexité d'un organisme nombre de gènes Corrélation positive Bactérie : 500 Humain : Beaucoup d'ADN –sans information –dépotoir (!) –expression des gènes

22 22 Table I-1 Génomes ayant été totalement séquencés – (A) Eubactéries

23 23 Table I-1 Génomes ayant été totalement séquencés – (B) Archae

24 24 Table I-1 Génomes ayant été totalement séquencés – (C) Eucaryotes

25 25 Fig 4-13 Génome de Saccharomyces cerevisae 16 chromosomes Couleurs fonctions du pays qui a séquencé nucléotides 6000 gènes

26 26 Complexité d'un organisme génome ( ADN) Corrélation non systématique Génome humain = 200 X génome de Saccharomyces cerevisae Certaines plantes ou amphibiens = 30 X génome humain Amibe = 200 X humain Certains organismes proches les uns des autres = 100 X en raison de l'ADN en excès (même nombre de gènes)

27 27 Variation du nombre de chromosomes Homme : 46 Certains cervidés : 6 Certaines carpes : >100 Espèces très proches de Muntjac Pas de relations simple entre –nombre de chromosomes –complexité de l'espèce –taille du génome

28 28 Fig 4-14 Fusion de chromosomes

29 29 Analyse du séquençage du génome 1999 Séquençage du chromosome 22 (le plus petit)

30 30 Fig ,5% du génome

31 31 Analyse du séquençage du génome Science et Nature février 2001 Human Genome Project (2001)

32 32 Table 4-1 Données statistiques du chromosome 22 et de tout le génome humain

33 33 Génome humain 25 fois plus gros que tous les génomes séquencés précédemment 8 fois la somme de tous les génomes séquencés précédemment Séquençage à 1000 nucléotides par seconde A fait reconsidérer toute la biologie 4 ème édition du livre entièrement revue

34 34 Fig 4-16 Échelle du génome –(A) si 1 mm entre deux bases… –(B) génome = km –un gène codant pour une protéine tous les 300 mètres –un gène 30 mètres

35 35 Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans le chromosome 1 - Quelques % codent pour des protéines ou de l'ARN de structure ou catalytique Le reste = petits morceaux d'ADN mobiles qui se sont incorporés dans le chromosome au cours de l'évolution

36 36 Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans le chromosome 2 - Taille moyenne d'un gène élevée –une protéine moyenne = 430 acides aminés paires de nucléotides –or un gène moyen = paires de nucléotides –beaucoup d'ADN non codant qui s'intercale dans l'ADN codant : introns / exons –Alternance exons / introns dans les gènes –Pas d'introns dans les organismes à génome compact moins d'ADN –Séquences régulatrices d'ADN des dizaines de milliers de paires de nucléotides

37 37 Fig 4-17 Séquence nucléotidique du génome humain –LINES, SINES, retro-viral like elements, DNA only transposons : éléments génétiques mobiles qui se sont multipliés et insérés en différents endroits du génome

38 38 Fig 4-17 Séquence nucléotidique du génome humain –Segmental duplications : gros blocks (1 000 à nucléotides) présents à 2 ou plus endroits du génome –Simple sequence repeats (< 14 nucléotides) répétés encore et encore

39 39 Fig 4-17 Séquence nucléotidique du génome humain –Plus de la moitié des séquences uniques sont des gènes –Le reste probablement des séquences régulatrices

40 40 Trois remarques générales sur l'arrangement des gènes dans le chromosome 3 - Grand désordre dans l'information –grande pagaille, fouillis, désordre –beaucoup d'ADN dépotoir –information importante répartie dans tout ce désordre –on n'a jamais rien éliminé

41 41 Problèmes posés par l'étude des gènes La plupart de l'ADN est probablement sans importance Un exon 145 nucléotides en moyenne (petit) Exon flotte dans une mer d'ADN inutile Nombreux réarrangements

42 42 Solutions pour l'étude des gènes Basées sur l'observation : les séquences qui ont une fonction sont conservées pendant l'évolution Comparaison homme / souris : l'homme et la souris ont divergé d'un ancêtre commun il y a 100 millions d'années Les régions semblables sont celles dans lesquelles les mutations ont éliminé l'animal porteur par sélection naturelle : ce sont les régions conservées ( non conservées) Les expériences de la nature permettent de mettre en lumière les régions les plus intéressantes du génome

43 43 Fig 4-18(AB) Conservation de la synténie (ordre de gènes) entre l'homme et la souris HOMME SOURIS

44 44 Fig 4-19 Histoire de notre chromosome 3 par comparaison avec celui d'autres mammifères Un changement tous les 5 à 10 millions d'années

45 45 Muller,S2000p206P NAS (fig1)

46 46 Muller,S2000p206PNA S (fig2)

47 47 Muller,S2000p206PNAS (fig3)

48 48 Muller,S2000p206PNAS (fig4)

49 49 Muller,S2000p206 PNAS (fig5)

50 Cycle du chromosome Cycle cellulaire Interphase : réplication chromosome interphasique Mitose : condensation et séparation chromosomes mitotiques : bien visibles

51 51 Fig 4-20 Cycle cellulaire Interphase synthèse protéique réplication de l'ADN et duplication des chromosomes Phase M Mitose Division cellulaire

52 52 Fig 4-21 Chromosome interphasique Chromosome métaphasique

53 Séquences nécessaires et suffisantes pour se dupliquer et passer d'une génération à l'autre Origines de réplication –séquence d'ADN spécialisée –kinétochore –jusqu'à paires de nucléotides chez l'homme Télomères 2 par chromosome Centromère

54 54 Fig 4-22 les trois séquences d'ADN nécessaires pour le maintien d'un chromosome

55 Emballage de l'ADN L'ADN est compacté en chromosomes eg : chromosome 22 = 48 millions paires de nucléotides –ADN étiré = 1,5 cm –interphase plus court –métaphase = 2 m – compaction = Protéines de compaction En interphase compaction = 1 000

56 56 Aspect dynamique du chromosome En fonction du cycle cellulaire En fonction de l'activité du chromosome –accès aux séquences spécifiques –expression des gènes –réplication de l'ADN

57 57 a) La fibre nucléosomale Chromatine –ADN (50 %) –Protéines (50 %) histones (60 millions de molécules de chaque classe par cellule) protéines chromosomiques non histones Nucléosome

58 58 Fig 4-23 Fibre de 30 nm Après traitement : collier de perles Nucléosomes en microscopie électronique Cordon = ADN, perle = cœur nucléosomal

59 59 b) Noyau nucléosomal De l'ADN (146 pn)... enroulé autour d'un noyau protéique formé de 8 histones 2 X (H2A, H2B, H3, H4) Premier niveau d'emballage de l'ADN (compacte l'ADN de 1/3)

60 60 Fawcett

61 61 Fawcett

62 62 Cook

63 63 Cook20 0?p? Digestion de la chromatine par les nucléases qui coupent l'ADN entre les nucléosomes –cf. Cook

64 64 Cook,P20 01p? Digestion faible : l'ADN exposé entre les noyaux nucléosomaux (= ADN de liaison) (linker DNA) est dégradé

65 65 Fig 4-24haut Noyau nucléosomal = 146 paires de nucléotides+ octamère d'histones

66 66 Fig 4-24bas Cœur protéique = octamère d'histones

67 67 ADN de liaison (linker DNA) Variable, de quelques paires de nucléotides à 80 paires de nucléotides environ en théorie, 1 nucléosome = 1 noyau nucléosomal + 1 ADN de liaison adjacent en pratique, 1 nucléosome = 1 noyau nucléosomal En gros, il y a un nucléosome tous les 200 paires de nucléotides

68 68 Dans une cellule 6,4 milliards paires de nucléotides millions de nucléosomes

69 69 Structure du noyau nucléosomal Résolu en ,65 tours d'ADN autour de l'octamère d'histones

70 70 Fig 4-25 Noyau nucléosomal (diffraction des rayons X)

71 71 1 histone 102 ~ 135 acides aminés Structure commune : 3 hélices reliées par 2 boucles c) Histones

72 72 Fig 4-26 Dimère H2A-H2B en "poignée de main"Motif des 4 histones Organisation structurale des histones du cœur protéique

73 73 Formation du noyau protéique Formation d'un dimère H3 - H4 Formation d'un dimère H2A - H2B (Dimère H3 - H4) + (Dimère H3 - H4) = (Tétramère H3 - H4) Tétramère H3 - H4 + 2 (Dimère H2A - H2B) = noyau protéique

74 74 Fig 4-27haut Assemblage d'un octamère d'histone

75 75 Fig 4-27bas Assemblage d'un octamère d'histone Les 8 extrémités -N font saillie Dimère H3 - H4Dimère H2A - H2B

76 76 Interface ADN / histones 142 liaisons H entre ADN et histones Histones riches en lys et arg (+) ADN chargé (-) Longue queue N terminal modifications covalentes

77 77 Conservation des histones Parmi les plus conservées des protéines des eucaryotes H4 petit pois et H4 de la vache ne diffèrent que à 2 positions sur 104 Il existe des variants

78 78 d) Position des nucléosomes sur l'ADN Flexibilité de l'ADN Liaison d'autres protéines

79 79 Flexibilité de l'ADN Tout ADN peut s'enrouler autour d'un nucléosome (en principe) Il faut pouvoir courber l'ADN pour faire les 2 tours compression du sillon mineur AT est plus facile à courber que GC

80 80 Fig 4-28 Compression du petit sillon autour du nucléosome

81 81 Flexibilité de l'ADN Tout ADN peut s'enrouler autour d'un nucléosome (en principe) Il faut pouvoir courber l'ADN pour faire les 2 tours compression du sillon mineur AT est plus facile à courber que GC Certains nucléosomes ont une position très précise En général position approximative

82 82 Liaison d'autres protéines Favorise la liaison du nucléosome Obstacle à la liaison du nucléosome En fait tout est très dynamique

83 83 e) Fibre chromatinienne d'ordre supérieur "Collier de perles" = rare dans la cellule vivante Fibre de 30 nm beaucoup plus probable

84 84 Nombreux schémas de fibres de 30 nm Zigzag… et ses variations : "mosaïque fluide de variations sur le modèle zigzag" Éléments qui interviennent –l'ADN de liaison –protéines de liaison à l'ADN –séquence de l'ADN

85 85 Bednar,J1998(fig1)

86 86 Bednar,J1998(fig2)

87 87 Bednar,J1998(fig3)

88 88 Fig 4-29 Variations sur le modèle de la fibre de 30 nm en zigzag Interconversion des modèles les uns dans les autres

89 89 Fig 4-30 Irrégularités de la fibre de 30 nm –régions avec des protéines de liaison à l'ADN –ADN sans nucléosomes

90 90 Formation de la fibre de 30 nm Histone H1 Queues des histones

91 91 Histone H1 Mal conservée Liaison avec l'ADN et les protéines Grande importance du point de sortie de l'ADN hors du nucléosome

92 92 Fig 4-31 Rôle de H1 sur le nucléosome

93 93 Queues des histones Liaisons des nucléosomes les uns aux autres

94 94 Fig 4-32 Rôle hypothétique des queues d'histones dans la formation de la fibre de 30 nm –les queues aident à la formation de la fibre de 30 nm –contact entre les queues et le nucléosome adjacent en diffraction de rayons X –liaison entre queue et ADN

95 Régulation de lactivité de la chromatine a) Les complexes de remodelage de la chromatine b) Modifications des queues des histones

96 96 a) Remodelage de la chromatine : complexes de remodelage chromatinien Machines protéiques qui hydrolysent de l'ATP pour changer temporairement la structure des nucléosomes et l'ADN est lié moins fort au noyau protéique du nucléosome Mouvements de H2A H2B dans le noyau protéique

97 97 Conséquences du remodelage des nucléosomes Accès de protéines aux nucléosomes –expression des gènes, réplication, réparation de l'ADN –Le nucléosome peut rester dans un état remodelé même après la dissociation du complexes de remodelage chromatinien mais liaisons ADN-protéines relâchées Possibilité de changement de la position des nucléosomes le long de l'ADN

98 98 Fig 4-33 Modèle de mécanisme de certains complexes de remodelage chromatinie n Les contacts ADN - histones sont faibles

99 99 SWI-SNF-B chromatin- remodeling complex A member of the SWI/SNF family of ATP-dependent chromatin-remodeling complexes ; A multi-subunit complex that contains BRG1, BAF170, BAF155, BAF60a, BAF57, BAF53, actin, hSNF5/INI1, and BAF18

100 100 Abréviations BAFBrg1/Brm-associated factor; BAPBrm-associated protein; ChIPchromatin immunoprecipitation; HDAChistone deacetylase; HMGhigh mobility group; MNasemicrococcal nuclease; RSCremodels the structure of chromatin; SAGASpt–Ada–Gcn5–acetyltransferase; SWI/SNFmating type switching/sucrose non-fermenting; TBPTATA-binding protein

101 101 Nature Reviews Cancer 4, (2004) THE SWI/SNF COMPLEX CHROMATIN AND CANCER Charles W. M. Robert s & Stuart H. Orkin Chromatin consists of DNA wrapped around nucleosomes in progressively higher-order structures. Histone acetyltransferases (HATs) are an example of complexes that covalently modify DNA and lead to relaxation of chromatin structure. SWI/SNF uses ATP hydrolysis to slide nucleosomes along the DNA helix and expose the DNA to transcription factors. Often, these two types of complex work in concert to regulate transcription.

102 102 Kingston,RE1999 p2339(fig1)

103 103 Kingston,RE1999p2339 (fig2) Composition de différents complexes de remodelage chromatinien ATP-dépendent Famille de complexes SWI/SNF en pourpre Homologues ISWI en rouge

104 104 Kingston,RE1999p2339 (fig3)

105 105 Kingston,RE1999 p2339 (fig4)

106 106 Complexes de remodelage chromatinien Gros complexes protéiques de plus de 10 sous-unités Permettent l'accessibilité à l'ADN quand nécessaire Reformation des nucléosomes Contrôle étroit par la cellule Inactivés par phosphorylation pendant la mitose compaction

107 107 Fig 4-34 Mécanisme cyclique de perturbation et reformation des nucléosomes

108 108 Travers,A1999p311(fig1)

109 109 Travers,A1999p311(fig2)

110 110 Travers,A1999p311(fig3)

111 111 b) Modifications des queues d'histones Acétylation des lysines Méthylation des lysines Phosphorylation des sérines Ubiquitinylation

112 112 Fig 4-35(A) Modifications connues des 4 queues d'histones

113 113 Modifications des queues d'histones Avant ou après leur synthèse En général après l'assemblage en nucléosome Enzymes nucléaires –HAT (Histone Acétyl Transférase) –HDAC (Histone DéACétylase)

114 114 Modifications des queues d'histones Agit peu sur le nucléosome Agit sur la stabilité se la fibre de 30 nm : eg acétylation déstabilise la chromatine Attraction de protéines spécifiques Modifications code d'étirement de la chromatine à la cellule

115 115 Fig 4-35(B) Code de modifications des histones

116 116 Code de modifications des histones Nombreuses combinaisons de modifications Exemple : –vient d'être répliqué –ne pas transcrire

117 117 Conclusion : dynamisme de la chromatine Complexes de remodelage chromatinien Modifications des queues d'histones Compaction / décompaction permanente Coopération des deux mécanismes


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