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1 V - Transport cytosol reticulum endoplasmique. Schéma du routage.

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1 1 V - Transport cytosol reticulum endoplasmique

2 Schéma du routage

3 Le reticulum endoplasmique Chez tous les eucaryotes Plus de la moitié des membranes de la cellule Membrane continue, lumière continue 10 % du volume de la cellule

4 Principaux rôles Synthèse des lipides et des protéines Site de production de toutes les protéines transmembranaires et lipides des organites de la cellule –RE, Golgi, Lysosomes, Endosomes, Vésicules sécrétoires, Membrane plasmique –Lipides des membranes de mitochondries et peroxysomes (pas toutes) –Protéines destinées à l'extérieur –Protéines destinées à lumière de RE, Golgi, Lysosome passent par le RE

5 AC contre une protéine résidente du RE

6 Fig AC contre une protéine résidente du RE Cellule de plante vivante + protéine fluorescente

7 Thiéry,G1983 Fig 1

8 Thiéry,G1983 Fig 3

9 Thiéry,G1983 Fig 4

10 Thiéry,G1983 Fig 6

11 Bergeron,M1981 Sch 1

12 Généralités Le RE capture les protéines à partir du cytosol –protéines transmembranaires : destinée RE ou autre (membrane plasmique, …, ) –protéines solubles : destinée lumière d'un organite ou sécrétion Même signal de tri au départ dans le RE

13 Rappel : les deux types d'import Post-traductionnel –mitochondrie, noyau, peroxysomes Co-traductionnel –RE –pas de risque de repliement de la protéine avant son insertion pas besoin de chaperones –nécessité de fixer les ribosomes sur le RE RE granulaire (REG)

14 RE granulaire en microscopie électronique

15 Les deux populations de ribosomes Ribosomes liés : protéines transloquées dans le RE Ribosomes libres : toutes les autres protéines Ont la même structure Fonctionnent de la même façon La différence est la protéine qui est en train d'être synthétisée

16 Fig Le RE granulaire

17 Polyribosomes attachés à la membrane du RE

18 Fig 12-37(A) Il n'y a pas de signal RE

19 Fig 12-37(B) Le signal RE de la nouvelle chaîne dirige le ribosome vers la membrane du RE

20 Le RE lisse C'est du RE sans ribosomes Toutes les cellules en ont –élément de transition d'où bourgeonnent les vésicules –en continuité avec le REG Très développé dans les cellules qui ont un métabolisme lipidique important –eg : les cellules qui fabriquent des hormones stéroïdes à partir du cholestérol

21 Fig 12-38(A) REL abondant dans une cellule de Leydig

22 Fig 12-38(B) Reconstruction 3-D de REG et REL dans un hépatocyte

23 Rôle de REL dans le métabolisme des lipides Hépatocyte : lieu de production des particules de lipoprotéines (transporteurs des lipides) Enzymes de synthèse localisées dans la membrane du REL Détoxification –cytochrome P450 (solubilise des toxiques) –phénobarbital doublement de la surface du REL en quelques jours puis résorption par autophagocytose

24 Autres rôles du REL Séquestration du calcium Beaucoup de Calcium Binding protein Exemple : le reticulum sarcoplasmique Ca ++ ATPase qui pompe le Ca ++ vers la lumière

25 Microsomes Origine technique de préparation de laboratoire Petites vésicules fermées Granuleuses ou lisses Proviennent de toutes les membranes de la cellule Sont fonctionnels (synthèse de protéines, glycosylation des protéines, captage du Ca ++, synthèse de lipides)

26 Origine des microsomes Lisses : membrane plasmique, Golgi, endosomes, mitochondries … –exception : hépatocyte où REL microsomes lisses Granulaire : RER uniquement

27 Fig 12-39(A) Isolement de microsomes rugueux et lisses à partir du reticulum endoplasmique

28 Fig 12-39(B) Microsomes rugueux

29 Reticulum endoplasmique rugueux et microsomes rugueux

30 Comparaison REG REL Continuité de membrane Continuité de lumière Grande similitude de protéines Plus de 20 protéines en plus dans le REG il existe une séparation entre les deux –protéines de liaison des ribosomes à la membrane –protéines qui donnent la forme aplatie au REG –interactions entre les protéines spécifiques ? ou réseau sur une des deux faces

31 Découverte du signal peptide Au début des années '70 Protéines sécrétées ARNm + ribosomes (sans microsomes) in vitro protéines plus longue que la protéine normale (leader peptide en plus) ARNm + ribosomes + microsomes granuleux protéines de taille correcte hypothèse du signal : –le leader peptide sert de signal pour diriger la protéine vers le RE –clivage par une signal peptidase dans la membrane du RE avant la fin de la synthèse

32 Le clivage a lieu dans la lumière du RE Synthèse de la protéine sans microsome + protéase dégadation de la protéine Synthèse de la protéine avec microsome + protéase pas de dégradation de la protéine (protection par la membrane du microsome) Protéines sans signal ne sont pas importées dans les microsomes dégradation

33 Hypothèse du signal S'applique : –plante + animal + membrane plasmique de la bactérie –mitochondrie, chloroplaste, peroxysome –protéines sécrétées –en fait toutes les protéines fabriquées par les ribosomes liés Confirmée par les résultats à partir de protéines de fusion

34 Fig Hypothèse originaleHypothèse originale du signal peptide

35 Guidage de la séquence signal RE Signal Recognition Particle (SRP) –navette entre membrane du RE et cytosol –se lie à la séquence signal Récepteur de SRP dans la membrane du RE

36 Signal Recognition Particle Très conservé 11S RNP 6 chaînes polypeptidiques différentes : 72, 68, 54, 19, 14, 9 –SRP 68/72,19, 54 : liaison au centre = domaine S 1 molécule dARN (300 nucléotides appelé 7SL RNA)

37 Anatomie fonctionnelle de SRP 2 extrémités –liaison au ribosome et blocage de la traduction –liaison à la séquence signal RE du polypeptide en élongation 3 sites de reconnaissance –Ribosome –Séquence du signal RE –Récepteur de SRP

38 Fig Signal Recognition Particle (SRP) bactérie

39 Liaison au signal RE du polypeptide en élongation Poche bordée dacides aminés hydrophobes (riche en méthionine domaine M) donc très flexible grande flexibilité pour s'adapter à beaucoup de types de protéines

40 Séquence signal du Reticulum endoplasmique Grande variation dans la séquence des acides aminés 8 ou plus acides aminés non polaires à leur centre Peut être accepté par la poche hydrophobe de SRP

41 Wild,K2002 fig1 Chez eucaryote –2 domaines Alu : SRP 14 et 9 S : SRP 72/68 et SRP 54 –Domaine M(ethionine-rich) –Domaine N(terminal) G(TPase) Ffh = homologue de SRP 54

42 Wild,K2002 fig2 Crystal structures of three protein–RNA subcomplexes from the SRP

43 Wild,K2002 fig3 Fold of SRP RNA-binding proteins compared with common RNA-binding domains

44 Wild,K2002 fig4 Structure and assembly of the Alu domain of the SRP H. sapiensS.pombeB. subtilis Proposed hierarchical assembly pathway for the mammalian Alu RNP

45 Wild,K2002 fig5 The structure of the human SRP19–helix 6 complex (a) Overall structure (b) A comparison of the GNAR and GNRA tetraloops

46 Wild,K2002 fig6 Towards the structure of the mammalian SRP

47 Stroud,RM1999 Fig 2 7S RNA 4.5S RNA

48 Stroud,RM1999Fig Domaine M(éthionine rich) de Ffh

49 Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE Liaison de SRP à la séquence signal Arrêt de la synthèse protéique Fixation du ribosome à la membrane du réticulum endoplasmique pas de libération prématurée (lysosome) Fixation du complexe SRP-ribosome au récepteur du SRP Rapprochement du complexe vers un translocateur Libération de SRP de son récepteur Translocation de la chaîne protéique naissante à travers la membrane du réticulum endoplasmique

50 Fig 12-42(A) Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE

51 Fig 12-42(A) Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE

52 Fig 12-42(B) Guidage de la séquence signal et de la SRP vers la membrane du RE

53 Résumé : les 5 acteurs Cytosol –SRP –Séquence signal RE de la chaîne naissante –Ribosome RE –SRP-r –Translocateur

54 Stroud,RM1999Fig 1 Aspect énergétique : GTP

55 Le translocateur : Sec61 Pore aqueux 3 à 4 complexes protéiques Chaque complexes = protéines transmembranaires Structure en beignet Alignement du translocateur avec le tunnel de la grosse sous - unité du ribosome Puis "soudure" translocateur - ribosome

56 Science, Vol 278, Issue 5346, , 19 December 1997 Alignment of Conduits for the Nascent Polypeptide Chain in the Ribosome- Sec61 Complex Roland Beckmann, Doryen Bubeck, Robert Grassucci, Pawel Penczek, Adriana Verschoor, Günter Blobel, Joachim Frank Three-dimensional reconstruction of the ribosome- Sec61 complex in a surface representation

57 Science, Vol 278, Issue 5346, , 19 December 1997 Alignment of Conduits for the Nascent Polypeptide Chain in the Ribosome- Sec61 Complex Roland Beckmann, Doryen Bubeck, Robert Grassucci, Pawel Penczek, Adriana Verschoor, Günter Blobel, Joachim Frank Three closeup views of the Sec61 oligomer. (A) Surface facing the ribosome. There is a vestibule (diameter of 35 Å) formed by the funnel-like structure and the pore (diameter of 15 Å). (B) Surface facing away from the ribosome. (C) View of the side opposite the attachment site. The ribosome would be located underneath the channel. The wall opposite the attachment site is thinner and more irregular. Arrows indicate the attachment site. Scale bar, 50 Å.

58 Fig "Soudure" entre le ribosome et le translocateur (Sec61) –A - Vue latérale ribosome - Sec61 –B - Vue du cytosol –C - Schéma

59 Fig Mise en évidence de la soudure étanche entre ribosome et translocateur (Sec61)

60 Le pore aqueux Continuum entre le tunnel du ribosome et le canal aqueux du translocateur Le pore n'est pas ouvert en permanence : se referme pour éviter la fuite du Ca ++ du RE vers le cytosol Structure dynamique C'est la séquence signal qui ouvre le pore au bout d'un certain temps d'alongement de la chaîne 2 reconnaissances de la séquence signal –SRP –translocateur (pour ouvrir le pore)

61 Le transport n'est pas toujours co-traductionnel Levure, paroi bactérienne ( RE)

62 Fig 12-45(A) Translocation co- traductionnelle Pas de nécessité d'énergie (pour l'importation)

63 Translocation post traductionnelle Sec A –que dans les bactéries –pas de Sec61 –moteur protéique –c'est une ATPase –fonctionne comme un piston Bip (Binding protein) –c'est une proteine chaperonne hsp70 –se fixe sur la chaîne en émergence –grâce à d'autres Sec fixées à Sec61 –cycle de liaison et libération translocation

64 Translocation post- traductionnelle Fig 12-45(BC) Des Sec supplémentaires déposent des molécules de Bip sur la chaîne émergeante. Liaison et libération de Bip tirent sur la chaîne (comme le cliquet dans la mitochondrie). Intervention de Sec A ATPase (exclusivement dans les bactéries) (piston)

65 La signal peptidase Clive la séquence signal dans la lumière du RE Nécessite un site de reconnaissance différent de la séquence signal Les séquences signal RE situées à l'intérieur du polypeptide ne sont jamais clivées (pas de site de reconnaissance pour la signal peptidase) Mais servent à retenir les protéines transmembranaires

66 Les deux fonctions de la séquence signal Guide la protéine vers le reticulum endoplasmique Sert de signal de transfert "start" pour ouvrir le pore (start transfert signal)

67 La séquence signal Contact avec Sec61 ET les lipides de la membrane Il y a ouverture latérale du pore pour libérer la séquence signal clivée Il y a deux ouvertures dans le translocateur (pore + sortie latérale)

68 Translocation dans le réticulum endoplasmique 1.Protéines solubles 2.Protéines membranaires

69 Fig Translocation d'une protéine soluble

70 2 - Trois modèles d'insertion d'une protéine transmembranaire à un passage dans la membrane du RE Modèle 1 Modèle 2 Modèle 3

71 idem protéine soluble mais segment hydrophobe en plus… –donc présence d'une séquence signal qui est le start transfert signal ( autres modèles) … qui bloque le transfert (signal d'arrêt de transfert) (stop transfert sequence) qui ancre la protéine dans la membrane une fois le signal start libéré Extrémité -N luminale Modèle 1

72 Fig Protéine transmembranaire à un passage : modèle 1 (-N luminal)

73 La séquence signal est interne et sert de signal start à la translocation : c'est le segment de protéine suivant la séquence signal qui est transloqué dans la lumière du RE Extrémité -N cytosolique Modèle 2

74 Fig 12-48(A) Protéine transmembranaire à un passage : modèle 2 (-N cytosolique)

75 Modèle 3 La séquence signal est interne et sert de signal start à la translocation : cest le segment de protéine précédent la séquence signal qui est transloqué dans la lumière du réticulum endoplasmique Extrémité –N terminale

76 Fig 12-48(B) Protéine transmembranaire à un passage : modèle 3 (-N luminal)

77 Insertion d'une protéine transmembranaire à deux passages dans la membrane du RE Signal de transfert start suivi d'un signal de transfert stop

78 Fig Protéine transmembranaire à deux passages : (-N et -C cytosoliques)

79 Insertion d'une protéine transmembranaire à plusieurs passages dans la membrane du RE Signal de transfert start suivi d'un signal de transfert stop Suivi d'un signal de transfert start… Suivi d'un signal de transfert stop… Suivi d'un signal de transfert start...

80 Fig Insertion de la rhodopsine dans la membrane du RE

81 Établissement d'un cadre de lecture La SRP balaie la chaîne naissante de -N vers -C SRP considère la première séquence hydrophobe comme signal start Puis alternance de stop - start

82 SRP fixe ainsi l'asymétrie des membranes Cette asymétrie est conservée pendant les phénomènes de bourgeonnement et fusion Le mode d'insertion d'une nouvelle protéine dans la membrane du RE détermine l'orientation de cette protéine dans toutes les autres membranes L'asymétrie est inhérente au processus d'insertion dans la membrane et non pas à la protéine elle-même Asymétrie des membranes

83 Rôle de la lumière du RE dans la qualité des protéines Présence de protéines résidentes du RE –contenant un signal de rétention RE : -Lys-Asp-Glu-Leu-COO - Aide à l'assemblage et repliement correct des protéines Exemple 1 : protein disulfide isomerase (PDI) Exemple 2 : binding protein (BiP)

84 Exemple 1 : Protein Disulfide Isomerase (PDI) catalyse l'oxydation des – SH de cystéines en S – S le cytosol a un environnement réducteur ( excès d'électrons – SH prédominant)

85 Exemple 2 : Binding Protein (BiP) BiP reconnaît les protéines mal repliées Se comporte comme la famille des hsp 70 pour l'importation dans les mitochondries –Capable d'hydrolyser ATP se fixe sur les séquences d'acides aminés qui devraient être –soit enfouies –soit nécessaires à l'assemblage de la chaîne –eg alternance d'acides aminés hydrophobes et hydrophiles qui devraient faire des plis Aide à maintenir de telles protéines dans le RE

86 Nat Struct Biol : Albanèse,V 2002(fig1) Rôle du site de sortie du ribosome dans le repliement des protéines chez les bactéries et dans la sécrétion protéique des eucaryotes

87 Glycosylation dans le réticulum endoplasmique Une des principales fonctions du réticulum endoplasmique glycoprotéines –Presque toutes les protéines fabriquées dans le RE solubles et membranaires sont glycosylées Les protéines du cytosol le sont très peu Glycosylation dans le Golgi (plus rare) – O lié sur le OH d'une sérine ou thréonine ou hydroxylysine (cf. infra)

88 Fig Précurseur oligosaccharidique ajouté à presque toutes les protéines du réticulum endoplasmique granulaire

89 Fig Glycosylation dans le réticulum endoplasmique –Intervention de oligosaccharyl- transférase –a lieu pendant la synthèse de la protéine –Le plus souvent N lié sur une asparagine

90 Fig Intervention du dolichol

91 Importance de la glycosylation Certaines protéines ont besoin d'être N- glycosylées pour se replier correctement Intervention de deux protéines chaperone du RE –calnexine –calréticuline

92 Calnexine et calréticuline Nécessitent du Ca ++ pour leur activité Sont des lectines Se lient aux oligosaccharides des protéines mal repliées et les retiennent dans la lumière du RE Empêche l'agrégation des protéines mal repliées Reconnaissent les oligosaccharides N-liés qui ont un simple glucose terminal donc interviennent après la suppression de 2 des 3 glucoses de l'oligosaccharide Calnexine : membrane du RE Calréticuline : lumière du RE

93 Comment calnexine et calréticuline reconnaissent-elles une protéine bien repliée d'une protéine insuffisamment repliée ? Intervention d'une autre enzyme du RE : une glycosyl-transférase qui ajoute toujours un glucose aux oligosaccharides qui ont perdu leur dernier glucose et qui sont attachés à une protéine mal repliée Cycle glucosidase (ablation) / glycosyl transférase (addition)

94 Fig Rôle de la glycosylation N-liée dans le maintien du repliement correct des protéines

95 Dislocation des protéines du RE vers le cytosol Beaucoup de protéines arrivent dans la lumière du RE mal ou pas repliées Elles retournent dans le cytosol par le même Sec61 (rétrotranslocation appelée dislocation) où elles sont dégradées Comment sont-elles reconnues ? Un fois dans le cytosol, les oligosaccharides sont retirés par une glycannase Puis ubiquitinylation Dégradation dans les protéasomes

96 Fig Retour des protéines du RE mal repliées vers le cytosol Même sort pour protéines solubles et membranaires Intervention de protéines accessoires associées au translocateur pour fonctionner dans les deux sens

97 Réponse à une augmentation de protéines mal repliées Si protéines mal repliées –Dans le cytosol chaperones cytosoliques –Dans le RE, de la transcription des gènes qui codent pour les chaperones du RE La voie de signalisation vers le noyau est bien connue chez la levure… Exemple de régulation par épissage d'un ARN messager (!)

98 Fig (A) Réponse chez la levure à une augmentation de protéines mal repliées

99 Ancrage d'un GPI (Glycosyl Phosphatidyl Innositol) à une protéine membranaire Dans le cytosol il y a addition de chaînes d'acide gras ou de prényl à des protéines pour qu'elles deviennent membranaires idem pour les protéines du RE : liaison d'un GPI à la protéine qui deviendra membranaire Une fois dans la membrane plasmique, pourra être libérée facilement par une phospholipase

100 Fig Attache d'un GPI à une protéine dans le RE

101 Rôle du réticulum endoplasmique dans la synthèse des lipides membranaires Le RE synthétise presque tous les lipides des membranes (phospholipides, cholestérol... ) La synthèse a lieu dans le feuillet cytosolique de la membrane du RE idem pour PC (=lécithine), PE, PS et PI Action d'une scramblase pour équilibrer les deux feuillets (flip-flop normalement rare) –scramblase : non spécifique (équilibre quantitatif) –flippase : spécifique (maintien de l'asymétrie)

102 Fig 12-58(A) Synthèse de la phosphatidyl choline (PC)

103 Fig 12-58(B) Synthèse de la phosphatidyl choline (PC)

104 Fig 12-59(A) Membrane du RE Rôle des translocateurs phospholipidiques : la scramblase

105 Fig 12-59(B) Membrane plasmique Rôle des translocateurs phospholipidiques : flippase ( PS et PE vers la face cytosolique)

106 Autres lipides membranaires Céramide glycolipides et sphingomyéline dans le Golgi Autres membranes

107 Les deux systèmes de membrane Membrane plasmique, RE, Golgi, Lysosomes, endosomes, vésicules : échange des lipides et protéines (trafic membranaire) Mitochondries, peroxysomes (?) sont exclus de ce système –protéines : importées du cytosol –lipides : à importer du RE directement ou indirectement protéines d'échange des phospholipides

108 Protéines d'échange des phospholipides Transporteurs solubles de lipides Extraction suivie de diffusion Transportent une molécule de phospholipide à la fois Se fait d'une membrane riche vers une membrane pauvre

109 Fig Protéines d'échange des phospholipides Équilibrage des deux feuillets ? Membrane interne de la mitochondrie ?

110 Signal sequence recognition and protein targeting Stroud,RM1999 Fig 4

111 Stroud,RM1999 Fig 5 Signal sequence recognition and protein targeting


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