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Le cytosquelette I - Les principes communs aux trois types de filaments, assemblage, désassemblage II - Régulation des filaments du cytosquelette III -

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1 Le cytosquelette I - Les principes communs aux trois types de filaments, assemblage, désassemblage II - Régulation des filaments du cytosquelette III - Les moteurs moléculaires IV - Fonctions du cytosquelette dans la cellule

2 II - Régulation des filaments du cytosquelette

3 3 Dynamisme des éléments du cytosquelette Régulation des filaments en longueur, stabilité, nombre et géométrie Interagissent les uns avec les autres et avec les autres composants de la cellule Parfois liaisons covalentes de protéines accessoires – Soit avec les sous-unités – Soit avec le filament

4 4 Plan A. Nucléation B. Protéines de liaison dynamisme du cytosquelette C. Organisation d'ordre supérieur D. Fixation des éléments du cytosquelette à la membrane plasmique

5 5 A – Nucléation 1. Nucléation des microtubules a) -tubuline b) Centrosome c) Autres cas 2. Nucléation des microfilaments

6 6 1 - Nucléation des microtubules Centre Organisateur des MicroTubules (COMT) = site de nucléation des microtubules dans la cellule -tubuline = nucléation des microtubules De la levure à l'homme Présente dans tous les COMT -tubuline ring complex ( -TuRC) = COMT très puissant

7 7 a) - Nucléation des microtubules par la -tubuline Nucléation à lextrémité moins Allongement par lextrémité plus Intervention de deux protéines qui se fixent directement à la -tubuline

8 8 Fig16-22 Nucléation d'un microtubule par -TuRC Présence des deux protéines plus des protéines accessoires pour aider à la création de lanneau -tubuline ring complexes en microscopie électronique MT nucléés à partir de - tubuline ring complexes purifiés

9 9 Moritz,M2001(fig1) Modèles de nucléation des microtubules Microtubule nucléé spontanément à partir de tubuline / pure Modèle avec matrice Modèle protofilament

10 10 Moritz,M2001(fi g2) Structure de -tubuline ring complexes isolés de drosophile Dgrip Drosophila gamma ring protein

11 11 Moritz,M2001(fig4) New models of microtubule nucleation by the -TuRC or monomeric -tubulin TuSC : -tubulin small complex Dgrip : Drosophila gamma ring protein

12 12 b) - Le centrosome : principal centre organisateur des microtubules Situé près du noyau Émanation des microtubules en étoile à partir du centrosome Extrémité - des MT dans le centrosome Extrémité + des MT en périphérie Contient plus de 50 copies de -TuRC dans sa matrice Contient une paire de centrioles

13 13 Fig16-23 Le centrosome

14 14 Les centrioles id corpuscules basaux des cils et des flagelles Matériel péricentriolaire = matrice centrosomale Duplication des centrioles suivie de la duplication des centrosomes cf. mitose

15 15 Structure des centrioles Cylindre de microtubules + protéines accessoires

16 16 Fig16-24 Un centriole dans un centrosome Matrice centrosomale fibreuse

17 17 c) - Cas particuliers de COMT Champignons et diatomés – pas de centriole – plaques incluses dans l'enveloppe nucléaire : corps du pôle du fuseau Plantes supérieures – pas de centriole – COMT répartis tout autour de l'enveloppe nucléaire Présence de -tubuline dans tous les cas

18 18 Orientation des microtubules Configuration en étoile des microtubules Extrémité plus tournée vers lextérieur de la cellule Extrémité moins tournée vers le noyau Dispositif de surveillance – de la périphérie de lintérieur de la cellule – et de la position centrale du centrosome conservé même in vitro…

19 19 Fig16-25 Positionnement du centrosome au centre de la cellule Centrosome isolé + tubuline dans une chambre artificielle en plastique (image toutes les 3 minutes)

20 20 Positioning of MTOCs in microfabricated chambers. (a) Three differential interference contrast images of a centrosome in a square chamber. The chamber is 4 μm deep and the tubulin concentration is 3.2 mg/ml. Images are 3 min apart. The slope of the well dominates the signal close to the edges of the chamber. (b) Three fluorescence images of an AMTOC in a square chamber. The chamber is 6 μm deep and the tubulin concentration is 1.4 mg/ml. Time is indicated in each frame. (c) An aster regrown from an AMTOC in 2.3 mg/ml tubulin, stabilized by diluting with 30% (vol/vol) glycerol/BRB80, spun down through a cushion of 40% glycerol/BRB80 onto a coverslip coated with 3-aminopropyltriethoxysilane, and fixed with glutaraldehyde. Image taken by confocal fluorescence microscopy. (d) Two centrosomes in a square chamber. (All bars are 10 μm.) Holy,TE1997 Positionnement des COMTs dans des micro-chambres

21 21 Fig16-26 Mélanophore de poisson

22 22 MT = point de repère dans la cellule Permet de retrouver le centre de la cellule Permet de disposer les organites dans les cytosol Propriété intrinsèque des microtubules

23 Nucléation des microfilaments (d'actine) (Nucléation des MT : près du noyau) Nucléation des microfilaments : sur la membrane plasmique accumulation de microfilaments en périphérie définit le cortex cellulaire Cortex cellulaire – Couche de filaments dactine accumulés sous la membrane plasmique – Détermine la forme et le mouvement de la surface cellulaire forme 1-D : microvillosités, spicules, filopodes 2-D : lamellipodes

24 24 Fig16-27 Bord avant dun fibroblaste : nucléation des MF Incubation avec actine-rhodamine visualisant les nouveaux filaments dactine Anciens filaments existant avant la perméabilisation Nouveaux filaments formés sur le bord avant: site de nucléation des filaments 5 m

25 25 Symons,MH1991p503 Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts – MH Symons and TJ Mitchison J. Cell Biol : Figure 2. Localization of rhodamine-actin incorporation in fibroblasts fixed shortly after injection. (a-c) shows a detail of a cell simultaneously permeabilized and fixed 24 s after injection. –(a) Rhodamine stain, showing newly incorporated actin. The arrows outline the section corresponding to the profiles in (d). –(b) Fluorescein- phalloidin stain, showing both preexisting and newly incorporated filaments; –(c) rhodamine/fluorescein ratio image, the arrowheads delineate the lamellipodium, and correspond to the fat arrows marked in the intensity profiles. The appearance of the stress fibers in the ratio image (c) as yellow over a red background, while they are not visible in the rhodamine image (a) itself, is caused by the higher background in the perinuclear part of the rhodamine image, which is divided by the stress fibers in the corresponding area of the fluorescein image (b). –(d) Not shown Normalized intensity profiles from the respective channels along the lines delineated by arrows in a. ( - ) Fluorescein profile; ( ) rhodamine profile. The fat arrows in ddelineate the lamellipodium, the thin arrow indicates the front of the wave of incorporated actin. See Materials and Methods for further details. The color scale from green to purple corresponds to low and high rhodamine/fluorescein ratios, respectively. –Bars, (b) 10 /,m; (d) 2.5 Am. Figure 4. Steady-state incorporationof injected actin, showing a detail of a cell fixed 20 min after injection. –(a) Rhodamine stain, showing the incorporated actin. The arrows outline the section corresponding to the profiles in d. –(b) Phalloidin stain. –(c) Rhodamine/ fluorescein ratio image, arrowheads delineate the lamellipodium boundaries. –(d) Not shown Normalized intensity profiles along the section marked in a. Full-line fluorescein profile and dashed line, rhodamine profile. Fat arrows delineate the lamellipodium. –Bars : (b) 10 um; (d) 2.5 gym. Contrôle de la polymérisation de lactine dans des fibroblastes vivants et perméabilisés

26 26 Symons,MH1991p503 Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts – MH Symons and TJ Mitchison J. Cell Biol : Figure 5.Rhodamine-actin incorporation in saponin-permeabilized cells. –(a) rhodamine stain, showing exogenous actin incorporation ; –(b) fluorescein-phalloidin stain, showing preexisting and newly incorporated filaments; –(c) rhodamine/fluorescein ratio, arrowheads outline the lamellipodial boundary –(d) not shown / intensity profiles along the arrows shown in a. For this experiment 0.4 t.M RA was added together with 0.2 mg/ml saponin in permeabilization buffer and incubated for 5 min before fixation. –Bars : (b) 10 I,m; (d) 2.5 um. Control de la polymérisation de lactine dans des fibroblastes vivants et perméabilisés

27 27 Mécanisme de la nucléation Régulée par des signaux externes Catalysée par un complexe de protéines qui comprend deux Actine Related Proteins (ARPs)

28 28 Actin Related Proteins (ARPs) Catalysent la nucléation de l'actine 2 protéines proche à 45% de l'actine Fonction analogue à -TuRC pour la tubuline Comprend le complexe ARP (= Arp 2/3) Nuclée le filament à partir de lextrémité – Et allonge rapidement lextrémité + Peut se fixer latéralement embranchement

29 29 Fig16-28(AB) Rôle du complexe ARP dans la nucléation de l'actine

30 30 Fig16-28(C) Rôle du complexe ARP dans la formation du réseau d'actine

31 31 Electron micrographs of quick-frozen, deep-etched, and rotary-shadowed samples of Arp2/3 complex (A) and complex mixed with gelsolin-capped actin filaments (B-D). In the presence of Arp2/3, complex actin filaments form branching arbors with numerous end-to-side connections between filaments (B). The branch points appear to be rigid attachments with a fixed 70° angle between actin filaments (C) and frequently contain a globular mass at the point of attachment (C, left arrow in B). (D) Filaments partially decorated with Arp2/3 complex. (E) Globular masses associated with filament pointed ends in the presence of Arp2/3 complex. Conditions: buffer same as Fig. 11 Mullins,RD1998 Microscopie électronique de complexes Arp2/3 en congélation sublimation et ombrage rotatoire (A) et de complexes mélangés avec des filaments dactine cappés avec de la gelsoline (B-D).

32 32 Données évolutives -tubuline et ARP Très anciens Très conservés Duplication du gène codant pour tubuline ou actine avec une fonction de nucléation en plus par divergence et spécialisation

33 33 B – Protéines de liaison dynamisme du cytosquelette 1. Protéines de liaison aux sous-unités libres a) Actine i. Thymosine ii. Profiline b) Tubuline i. Stathmine 2. Protéines de liaison latérale a) Tubuline i. MAPs b) Actine i. Tropomyosine ii. Cofiline 3. Protéines de liaison aux extrémités a) Actine b) Tubuline

34 Protéines de liaison aux sous-unités libres a) Actine b) Tubuline

35 35 a) Actine Dans une cellule (non musculaire) : 50% actine filamenteuse / 50% actine soluble [Actine] en monomère dans une cellule : M (2-8 mg/ml) C c [Actine] en monomère en tube à essai : <1 M Pourquoi lactine soluble ne polymérise-t-elle pas en filaments dans la cellule ? Parce quil y a des protéines qui empêchent la polymérisation en se fixant sur les sous-unités

36 36 Protéines de liaison aux sous-unités libres dactine Thymosine : la plus abondante Profiline Ne peuvent être fixées en même temps

37 37 Thymosine Bloque l'actine libre Qui ne peut sassocier ni au bout + ni au bout - Bloque l'échange et/ou l'hydrolyse de ATP Empêche l'allongement Comment utiliser cette actine séquestrée ? – Système de régulation de la thymosine ? non – Intervention de la profiline ? oui

38 38 Profiline Se fixe sur l'extrémité + du monomère à lopposé de la gorge qui contient lATP (extrémité -) Bloque ainsi le côté du monomère qui sassocierait normalement à lextrémité – du filament Le complexe actine-profiline peut facilement se fixer sur lextrémité + libre dun filament. Dès que le complexe actine-profiline est additionné changement de conformation de lactine diminution de laffinité actine / profiline profiline part allongement facilité

39 39 Résumé thymosine-profiline Thymosine – Bloque le monomère partout Profiline – Allonge le filament à son bout + – « Déséquestre » lactine de la thymosine

40 40 Fig16-29 Profiline liée à un monomère d'actine Fixée sur l'extrémité + à lopposé de la gorge qui contient lATP Peut allonger lextrémité + du filament Ne peut pas allonger lextrémité – du filament + –

41 41 Compétition thymosine – profiline Compétition pour se fixer au monomère dactine Activation locale de molécules de profiline libération de lactine séquestrée par la thymosine

42 42 Fig16-30(1) Résumé : Effets de la thymosine et de la profiline sur la polymérisation de l'actine

43 43 Fig16-30(2) Effets de la thymosine et de la profiline sur la polymérisation de l'actine

44 44 Régulation de lactivité de la profiline Par phosphorylation Par liaison aux phospholipides inositol (PI) Protéines intra cellulaires avec domaines riches en proline

45 45 Sites de régulation de la profiline Membrane plasmique Se lie aux phospholipides de la membrane plasmique En relation étroite avec lextérieur pour faire croître lamellipodes ou filopodes

46 46 b) Tubuline C de tubuline libre dans la cellule > C c [tubuline] en monomère en tube à essais Pourquoi la tubuline soluble ne polymérise-t- elle pas en microtubules dans la cellule ? Parce quil y a des protéines qui séquestrent la tubuline libre

47 47 La stathmine Se fixe sur deux hétérodimères de tubuline et empêche leur addition aux microtubules Diminue ainsi la concentration de tubuline disponible pour la polymérisation (comme la colchicine)

48 48 La stathmine Taux délongation dun MT = K on x [tubuline] Si [tubuline] taux délongation Or la stathmine [tubuline] en la séquestrant Stathmine taux délongation du MT

49 49 La stathmine Le passage de létat de croissance au désassemblage du microtubule est une course entre lhydrolyse du GTP et lallongement du filament Comme la stathmine [tubuline] en la séquestrant Stathmine le désassemblage du microtubule

50 50 Fig16-31 Effets de la stathmine (=oncoprotéine 18) sur la polymérisation des microtubules

51 51 Régulation de lactivité de la stathmine Phosphorylation de la stathmine inhibe la fixation à la tubuline Phosphorylation de la stathmine – taux délongation du microtubule – le désassemblage du microtubule (suppression de linstabilité dynamique)

52 Protéines de liaison latérale Protéines qui se fixent le long du polymère pour le stabiliser ou le déstabiliser a) Tubuline b) Actine

53 53 a) Protéines de liaison latérale : tubuline Les Microtubules Associated Proteins (MAPs) = protéines liées le long des microtubules (par définition) Peuvent stabiliser les microtubules contre le désassemblage (comme le taxol) Interaction des microtubules avec les autres composants de la cellule Forment la structure de base des axones et dendrites

54 54 Fig m Localisation des MAPs dans les axones et les dendrites Protéine (vert) axone (ramifié) MAP 2 corps cellulaire et dendrites

55 55 Deux domaines aux MAPs Un domaine lié au microtubule Un domaine qui se projette en dehors dont la longueur conditionne le degré dempaquetage des microtubules – MAP 2 : long domaine externe faisceaux de microtubules espacés – Protéines : domaine externe court faisceaux de microtubules compacts

56 56 Fig16-33 Organisation des faisceaux de MT par les MAPs Cellule surexprimant MAP2Cellule surexprimant tau

57 57 Biochimie des MAPS (dont tau et MAP2) Nombreuses copies dun motif de liaison à la tubuline Ces MAPs + tubuline pure non polymérisée nucléation par stabilisation des premiers oligomères de tubuline Cibles de plusieurs protéine kinases

58 58 MAPs MAP2 et tau – Localisées dans certains types de cellules des vertébrés Autres MAPs – Rôle central dans la dynamique des microtubules chez presque tous les eucaryotes – XMAP215

59 59 XMAP215 – Xenopus microtubule associated protein (masse molaire=215) – Ubiquitaire – De la levure à lhomme – Se lie le long des microtubules (devrait être dans §3) – Capacité particulière à stabiliser les extrémités libres des microtubules – Inhibe le passage de croissance à raccourcissement des microtubules – Pendant la mitose il y a phosphorylation de XMAP215 inhibition de cette activité augmentation 10X de instabilité des microtubules

60 60 Fig A

61 61 Fig B Pendant la mitose, phosphorylation de XMAP215 Activité inhibée Instabilité dynamique des microtubules pendant la mitose multipliée par 10

62 62 b) Protéines de liaison latérale : actine Tropomyosine Cofiline (=actine depolymerising factor)

63 63 Tropomyosine Dans la plupart des cellules (pas que dans les cellules musculaires) Se lie à 7 sous-unités adjacentes dactine dans le filament Empêche linteraction avec dautres protéines Rôle dans la contraction musculaire

64 64 Fig.16-74

65 65 Cofiline (=actine depolymerizing factor) Déstabilise le filament dactine Peut se lier à la fois sur lactine et sur le filament (inhabituel) Force le filament à senrouler plus serré affaiblit les contacts entre les sous- unités dactine du filament filament plus cassant

66 66 Fig16-34 Modification de la morphologie du filament d'actine par la cofiline Filament plus court et plus épais

67 67 Mécanisme daction 1/2 Facilite la dissociation dune sous-unité dactine-ADP à lextrémité moins du filament Or cest la lenteur de la dissociation à lextrémité – qui limite le tapis roulant du filament La liaison à la cofiline accélération du tapis roulant Le durée de vie des filaments dans la cellule est beaucoup plus courte que de lactine pure en tube à essais

68 68 Mécanisme daction 2/2 La cofiline préfère se lier à des filaments contenant de lactine-ADP plutôt que de lactine-ATP Or lhydrolyse de lATP est plus lente que lassemblage du filament Les nouveaux filaments contiennent surtout de lATP-actine La cofiline déstabilise plus les anciens filaments que les nouveaux Accélère le turn over des filaments

69 Protéines de liaison aux extrémités du filament a) Actine b) Tubuline

70 70 Justification de ces protéines Protéines de liaison latérale (§ 2) – Modifient la dynamique du filament – Mais il en faut beaucoup (doit recouvrir tout le filament) 1 tropomyosine pour 7 actines 1 tau pour 4 tubulines 1 cofiline pour 1 actine Protéines de liaison aux extrémités du filament (§ 3) – Modifient la dynamique du filament – Mais peuvent être en très faible quantité 1 molécule par « filament » suffit (eg 1molécule pour actines)

71 71 a) Protéines de liaison aux extrémités du filament : actine Protéines « cappantes » « cap » lextrémité + du filament où ont lieu les changements les plus rapides du filament une fois que lATP de lextrémité sest transformée en ADP Ralentit considérablement les vitesses dallongement et de raccourcissement du filament en rendant lextrémité + inactive

72 72 Fig16-35 Effet du capping des filaments (actine et pas tubuline) sur leur dynamique

73 73 Protéines cappantes La plupart des filaments sont « capés » à leur extrémité + eg : protéine CapZ (strie Z du muscle) Complexe ARP à lextrémité – dun filament (celui qui a permis la nucléation)

74 74 Régulation du « capping » Régulation locale pour adapter le cytosquelette Signaux intra cellulaires PIP 2 (phosphatidyl Inositol-2 Phosphate) régule les protéines qui « cappent » lextrémité + de PIP2 dans le feuillet cytosolique dé « cappe » lextrémité + allongement polymérisation en surface Dans les cellules musculaires durée de vie très longue des filaments dactine – CapZ au bout + – Tropomoduline au bout – – (+ Tropomysine tout le long pour stabiliser)

75 75 b) Protéines de liaison aux extrémités du filament : microtubule Beaucoup plus compliqué – 13 protofilaments – Tube creux Rôle dans la dynamique des microtubules Rôle dans le contrôle du positionnement des microtubules

76 76 Protéines de liaison aux extrémités du microtubule i. -tubuline ring complex ii. Complexe protéique spécial quon trouve aux extrémités des microtubules des cils (cf. infra) iii. Catastrophines iv. MAPs

77 77 i - -tubuline ring complex (déjà vu) Nuclée le microtubule « Cap » lextrémité –

78 78 ii - Complexe protéique spécial quon trouve aux extrémités des microtubules des cils (cf. infra)

79 79 iii. Catastrophines Jouent sur la fréquence des « catastrophes » Tendent à effilocher lextrémité du filament Appartiennent à la superfamille des kinésines Synonyme : famille Kin 1 (qui comprend KIF2 cf. moteurs infra)

80 80 iv. MAPs Action inverse : tendent à favoriser la croissance

81 81 Fig16-36(A) Effets de la liaison de protéines aux extrémités

82 82 Régulation des protéines de liaison aux extrémités du microtubule Toutes ces protéines sont régulées Cest ce qui se passe à la mitose

83 83 Fig A

84 84 Fig B Pendant la mitose, phosphorylation de XMAP215 Activité inhibée Instabilité dynamique des microtubules pendant la mitose multipliée par 10

85 85 Rôle dans le contrôle du positionnement des microtubules A lextrémité – : -tubuline ring complex A lextrémité + : protéines de localisation des microtubules dans le cortex cellulaire – eg :

86 86 Fig16-36(B) Conséquences de la liaison de protéines aux extrémités des microtubules EB1 = protéine cappante de MT (existe chez lhomme) Kar9 = protéine localisée vers la membrane Permet aux MT du fuseau de se diriger dans le bourgeon de croissance pendant la mitose

87 87 C - Organisation d'ordre supérieur (cross linking) Les protéines vues ci-dessus interviennent dans le dynamisme Il faut aussi stabiliser, assurer lintégrité mécanique, forme – Centrosome (nucléation, orientation des microtubules, milieu de la cellule…) – MAPs – Tropomyosine …

88 88 Différentes organisations faisant appel au cross linking Filaments intermédiaires – Association latérale des filaments entre eux – Protéines accessoires Actine – Deux types de protéines (tropomyosine pour stabilisation + autres protéines pour le cross linking) Microtubules – MAPs ont deux domaines (MT, extérieur)

89 89 Différentes organisations faisant appel au cross linking 1.Filaments intermédiaires 2.Les différents types dorganisation des filaments dactine 3.Effets de la fragmentation des filaments sur leur dynamique –Microtubules : catanine –Actine : gelsoline 4.Exemple : activation des plaquettes

90 Filaments intermédiaires

91 91 Organisation du réseau de filaments intermédiaires Structure du filament robustesse – Protéine NF-M et NF-H ont un domaine C- terminal qui forme une projection qui se lie aux FI voisins Filagrine : permet le maintien des faisceaux de FI de kératine Plectine : nombreuses propriétés

92 92 Plectine Permet le maintien des faisceaux de vimentine Lie les faisceaux de FI (vimentine) aux – Microtubules – Filaments dactine – Myosine II – Membrane plasmique

93 93 Fig16-37 MT Plectine FI Liaison des filaments intermédiaires aux filaments intermédiaires Liaison des filaments intermédiaires aux microtubules Liaison des filaments intermédiaires aux filaments épais de myosine Grâce à la plectine (anticorps marqués à l'or) Cross linking de la plectine aux différents éléments du cytosquelette

94 94 Mutations dans le gène de la plectine Maladie très grave – Épidermolyse bulleuse (filaments de kératine) – Dystrophie musculaire (filaments de desmine) – Dégénérescence nerveuse (neurofilaments) Chez la souris – Mort en quelques jours – Phlyctènes de la peau – Atteintes musculaire et cardiaque

95 Différents types d'organisation des filaments d'actine 1. Faisceau de filaments 2. Gel

96 96 Fig16-38 Organisation des filaments d'actine Fibres de stress (tension) Exploration de lenvironnement

97 97 2 types de protéines cross linking 1. Protéines formant les faisceaux Filaments parallèles Connexion rigide entre les deux domaines de liaison à lactine 2. Protéines formant un gel ou un réseau Filaments à grand angle Connexion à courbe rigide ou flexible Les deux ont deux sites identiques de liaison aux filaments dactine (monomère ou dimère)

98 98 Fig16-39 Quatre exemples de protéines de liaison à l'actine Deux sites de liaison à l'actine (avec séquence proche)

99 99 Exemples de protéines cross linking Faisceau Gel ou réseau

100 100 Faisceau Fimbrine – 14 nm entre deux filaments – Localisation dans les filopodes et bord avant – Microvillosité -actinine – 30 nm entre deux filaments (plus lâche) – Fibres de stress – Contacts focaux Villine – Deux sites proches de liaison à lactine ( fimbrine) – Microvillosité – Même famille que la gelsoline (cf. infra)

101 101 Gel ou réseau Filamine – liaison en V filaments à angle droit Spectrine – 200 nm – Forme un réseau Les protéines cross linking déterminent le type de structure dactine…

102 102 Fig16-40 Formation de deux types de faisceaux d'actine -Actinine purifiée

103 103 … Les protéines cross linking déterminent le type de structure dactine… …et donc le type des autres molécules qui vont interagir -actinine myosine II fibres de stress contractiles Fimbrine exclut la myosine les filopodes ne sont pas contractiles Villine fimbrine

104 104 Microvillosité Extension en doigt de gant de la membrane plasmique des cellules épithéliales 0,08 m x 1 m Cellules à fonction dabsorption Augmente la surface dabsorption x20 Entérocyte : plusieurs milliers de microvillosités au pôle apical 20 – 30 filaments dactine en faisceau Fimbrine + actine Fibroblaste injecté de villine microvillosité plus longues et plus nombreuses Bras latéraux de myosine I entre le faisceau dactine et les lipides de la membrane plasmique

105 105 Fig16-41(A) Microvillosité Extension en doigt de gant de la membrane plasmique des cellules épithéliales 0,08 m x 1 m Cellules à fonction dabsorption Augmente la surface dabsorption x20 Entérocyte : plusieurs milliers de microvillosités au pôle apical 20 – 30 filaments dactine en faisceau Fimbrine + villine Fibroblaste injecté de villine microvillosité plus longues et plus nombreuses Bras latéraux de myosine I entre le faisceau dactine et les lipides de la membrane plasmique

106 106 Fig16-41(BC) Microvillosité (cryofracture) Contient spectrine et myosine II Au-dessous : couche de filaments intermédiaires

107 107 Karl R. Fath and David R. Burgess Microvillus Assembly: Not actin alone Current Biology Volume 5, Issue 6, June 1995, Pages Fig. 1. A summary of the main events that correlate with the localization of the major actin-binding proteins to the microvilli during brush border formation. Three stages in the assembly of microvilli and the terminal web in the apical cytoplasm of a developing chicken enterocyte are illustrated. (a) Early membrane projections expressing both ezrin and villin contain several actin filaments lying near the membrane. (b) Later, as the microvillus elongates, the number of actin filaments increases and myosin-l links the core filaments with the microvillus membrane. Both plasma membrane and myosinmay be supplied to the microvillus by Golgi-derived vesicles. (c) Coincident with the appearance of fimbrin, the number and length of the actin filaments increases and the core filaments become hexagonally packed.

108 108 Formation de réseau : spectrine Conditionne la formation dun réseau Identifiée pour la première fois dans les globules rouges Protéine longue et flexible 4 chaînes polypeptidiques (Deux et deux ) Les sites dactine sont séparés de 200 nm Réseau à 2-D maintenu par de lactine sous la membrane plasmique dans le globule rouge Protéines membranaires

109 109 Fig 10-31

110 110 Globule rouge Cortex cellulaire rigide Reprise de la forme du globule rouge après passage dans un capillaire Équivalents de spectrine dans le cortex des autres types cellulaires des vertébrés

111 111 Formation dun gel : filamine Servent dans les lamellipodes qui permettent à la cellule de ramper sur un support

112 112 Fig16-42 Formation d'un gel (3-D) par la filamine

113 113 Fig16-43 Cellules de mélanome – Peu de filamine (mobilité anormale) Pas de lamellipodes Bulles anormales à la surface Peu de déplacement Pas de métastase – Restauration artificielle de la filamine Lamellipodes Hautement métastasiante

114 Effets de la fragmentation des filaments sur leur dynamique Cassure dun filament (en des douzaines de fragments) nombre dextrémités + et – – Sous certaines conditions : des sites de nucléation et allongement – Sous dautres conditions: dépolymérisation des vieux filaments – – Changement des propriétés physiques et mécaniques du cytoplasme – Les faisceaux et gels deviennent plus fluides

115 115 Fig16-44 Effets de la fragmentation des filaments sur leur dynamique

116 116 Intervention de protéines cassantes sur la longueur et la dynamique des MF et microtubules a) Microtubules – Katanine b) Actine – Gelsoline

117 117 a - Microtubules : katanine « épée » en japonais Peut casser les 13 protofilaments dun microtubule Deux sous-unités – Petite : hydrolyse ATP + casse le protofilament – Grosse : dirige la katanine vers le centrosome

118 118 Rôle de la katanine Libère les microtubules de leur point dattache à un centre organisateur de microtubules Applications – Dépolymérisation rapide des microtubules aux pôles du fuseau à la mitose – Cellules en prolifération – Neurones

119 119 Fig16-45 Cassure des microtubules par la katanine – 30 s après l'addition de Katanine – Même champ 3 minutes après l'addition de la Katanine MT marqués par la rhodamine et stabilisés par le taxol adsorbés sur une plaque de verre

120 120 b - Microfilaments dactine : gelsoline Superfamille des gelsolines Peut casser le filament dactine Activité activée par une forte [Ca ++ ] cytosolique Ne nécessite pas dATP

121 121 Gelsoline Possède des sous-domaines dont deux sites Qui se lient à deux sites différents de la sous- unité dactine – Un à la surface du filament – Un caché dans la liaison avec la sous-unité suivante

122 122 Mode daction présumé de la gelsoline Liaison sur le côté dun filament dactine par un des 2 sites de liaison de la gelsoline à lactine Fluctuation thermique fente entre des sous-unités voisines du protofilament dactine Infiltration de la gelsoline dans la fente Cassure du filament « Capping » de la gelsoline à lextrémité du filament par son 2 ème site de fixation à lactine Peut être retirée du filament par une augmentation de PIP 2

123 123 Fig16-46 Modèle de cassure du filament d'actine par la gelsoline

124 Application : activation des plaquettes Très bel exemple de Régulation des protéines accessoires à lactine Cassure, « capping », cross linking Grosses modifications morphologiques

125 125 Plaquette au repos Circule dans le sang Pas de noyau Forment le caillot Forme discoïde Actine sous forme de filaments courts « Cappés » par CapZ Beaucoup de monomères dactine liés à la profiline

126 126 Activation de la plaquette Par contact physique avec un vaisseau endommagé Ou agent chimique comme la thrombine

127 127 Mécanisme de lactivation Cascade de signalisation intra cellulaire – Afflux massif de Ca ++ dans le cytosol – Ca ++ active gelsoline – Gelsoline casse et « cap » les filaments en filaments plus petits – Qui sont maintenant « cappés » de gelsoline Cascade de signalisation intra cellulaire – de PIP 2 – Inactivation de gelsoline et CapZ – Qui sont retirées toutes les deux

128 128 Mécanisme de lactivation Augmentation du nombre dextrémités libres Qui sont rapidement allongés par les nombreuses sous-unités libres dactine Nombreux filaments longs

129 129 Intervention des autres protéines de liaison à lactine Ces nombreux filaments longs sont transformés en gel par la gelsoline Dautres sont transformés en faisceaux par - actinine et fimbrine

130 130 Fin de lactivation de la plaquette Formation de lamellipodes et filopodes pour recouvrir le caillot Et fixation des plaquettes au caillot par des intégrines

131 131 Retour au repos Le signal PIP 2 saffaisse CapZ retourne aux extrémités des filaments Les filaments redeviennent stables Les plaquettes reprennent leur forme étalée Myosine II hydrolyse de lATP pour glisse le long des filaments dactine les uns par rapport aux autres Contraction de la plaquette qui rapproche les berges de la plaie

132 132 Fig16-47(A) Activation plaquettaire

133 133 Fig16-47(BCD) Activation plaquettaire Avant lactivation Plaquette activée Après contraction de la myosine II

134 134 D - Fixation des éléments du cytosquelette à la membrane plasmique Rôle du cytosquelette dans la forme et la rigidité de la membrane plasmique de la cellule – Cortex du GR : réseau actine + spectrine – Microvillosité : faisceau actine + villine Deux facteurs dans le maintien de ces structures – Maintien des filaments dactine en faisceau et cross linking des filaments – Fixation spécifique des filaments dactine aux protéines ou lipides de la membrane plasmique De plus connexion des structures internes de la cellule à son environnement – Autres cellules – Matrice extra cellulaire

135 135 Continuum entre lintérieur et lextérieur de la cellule Éléments du cytosol > < protéines transmembranaires adhésion cellulaire Cf. chapitre matrice extra cellulaire pour connexions membrane matrice extra cellulaire

136 136 Famille ERM (Ezérine – Radixine – Moésine) Protéines intra cellulaires proches les unes des autres Attachent les filaments dactine à la membrane plasmique – Extrémité – C de la protéine se lie directement au filament dactine – Extrémité - N de la protéine se lie à la face cytoplasmique de glycoprotéines trans- membranaires dont CD44 (récepteur à lacide hyaluronique)

137 137 Neurofibromatose Maladie génétique Tumeurs nerveuses bénignes multiples Mutations dans les protéines ERM Mutation perte dune protéine (appelée merline) de la famille ERM

138 138 GENES & DEVELOPMENT 19: , 2005 REVIEW Membrane organization and tumorigenesisthe NF2 tumor suppressor, Merlin Andrea I. McClatchey and Marco Giovannini Merlin-organized complexes prevent mitogenic signaling and contact-dependent inhibition of proliferation. (Left) At low cell density in cell culture, Merlin is predominantly hyperphosphorylated and inactive and mitogenic signaling proceeds. Similarly, upon cell reattachment to certain ECM substrates, a pool of Merlin is rapidly phosphorylated. (Right) At high cell density in cell culture, Merlin is hypophosphorylated, self-associated, and active in mediating contact-dependent inhibition of proliferation. Merlin is recruited to nascent cell:cell boundaries where it appears to stabilize AJs between cells, perhaps by inhibiting Rac/Pak signaling and/or stabilizing the actin cytoskeleton. Under these conditions, Merlin may inhibit signaling from AJ-associated growth-factor receptors. Hypophosphorylated Merlin can also interact with cell:ECM receptors such as CD44, which binds to hyaluronic acid (HA); increased CD44:HA interaction with increased cell density leads to high levels of active Merlin, which may inhibit associated growth-factor receptors. Notably, complete cell detachment also leads to hypophosphorylation and activation of Merlin. Perhaps inhibited mitogenic signaling from multiple complexes accumulates, reaching a threshold that halts proliferation. The study and manipulation of cell:cell contact in two dimensions in cell culture is nonphysiological; in vivo cells in a tissue are contacting other cells and can override contact-dependent inhibition of proliferation under certain normal conditions or in the context of a tumor. Merlin may coordinate the receipt of physical information from the extracellular milieu with the receipt and processing of mitogenic stimuli.

139 139 Régulation des protéines dattachement des filaments dactine à la membrane plasmique Spectrine ou myosine I régulation par des signaux intra cellulaires Protéines ERM régulation par des signaux intra et extra cellulaires

140 140 Les deux conformations des protéines ERM Conformation déroulée active : oligomérise et se lie à lactine et à CD44 Conformation repliée inactive : les extrémités N – et C – terminales sont liées entre-elles Passage dune conformation à lautre – Phosphorylation – Liaison à PIP 2 En réponse à des signaux extra cellulaires

141 141 Fig16-48 Rôle des protéines de la famille ERM dans l'attachement des filaments d'actine à la membrane plasmique (ezrine, radixine, moésine)

142 142 Rapport du cytosquelette avec les jonctions cellulaires 1. Cytosquelette matrice extra cellulaire 2. Cytosquelette cellule voisine

143 Cytosquelette matrice extra cellulaire : contacts focaux Terminaison à leur niveau des fibres de stress constituées de faisceaux dactine et myosine II Présence dintégrines à leur niveau Intégrines (cf chapitre MEC) – Protéines dadhésion trans-membranaire – Se lient indirectement aux faisceaux dactine

144 144 Fonctions des contacts focaux Permet à la cellule de tirer sur son support : via fibres de stress Relais de signaux de la matrice extra cellulaire vers le cytosol : via FAK

145 145 Focal Adhesion Kinase (FAK) Cest une tyrosine kinase Activée par lagrégation des intégrines des contacts focaux Sensible au substrat de la cellule et la force de tension : comment ?? Cible de la Src tyrosine kinase cytoplasmique Phosphoryle de nombreuse cibles régule survie, croissance, prolifération, morphologie, mouvement, différenciation des cellules en réponse à lenvironnement

146 146 Fig16-49 Contacts focaux et fibres de stress dans un fibroblaste en culture Microscopie à contraste interférentiel Anticorps anti-actine

147 Cytosquelette cellule voisine: cadhérines Protéines trans-membranaires Queue cytoplasmique se lient aux caténines qui se lient à lactine Jonctions adhérentes = amas de contacts cellules-cellules à cadhérine-actine

148 148 Fig A-B Molécule de cadhérine

149 149 Fig C

150 150 Autres structures cytosquelette cellule voisine : desmosomes et hémidesmosomes Filaments intermédiaires – membrane plasmique Desmosomes : cellules - cellules Hémidesmosomes : cellules - matrice

151 151 Retentissement des signaux extra cellulaires sur le cytosquelette : deux cibles 1. Protéines associées aux éléments du cytosquelette Longueur, localisation, organisation dynamique Signal extra cellulaire cytosquelette via protéines accessoires 2. GTPases monomériques membres de la famille des protéine Rho* À lintérieur de la cellule Cible de nombreux récepteurs membranaires * (ne pas confondre avec Rab amarrage des protéines de transport

152 152 Famille des protéines Rho Rho GTP-Binding Proteins – Une grande famille de protéines monomériques de liaison au GTP impliquée Dans la régulation de lorganisation de lactine Lexpression des gènes Et la progression du cycle cellulaire This enzyme was formerly listed as EC Year introduced: 2000

153 153 Cells receive extracellular stimuli in the form of soluble molecules (growth factors, cytokines and hormones) that bind to cell surface receptors, adhesive interactions (extracellular matrix and cell-cell adhesion) or mechanical stresses (tension, compression and fluid shear stress). These stimuli act upon guanine-nucleotide-exchange factors (GEFs) and GTPase-activating proteins (GAPs) to control the activation state of the small GTPases Rho, Rac and Cdc42. Once activated, the GTPases bind to a spectrum of effectors to stimulate downstream signaling pathways. The pathways shown in the poster represent the major effector pathways for these Rho family GTPases. The total number of effectors is too large to be shown here, and I apologize to authors whose work could not be included. [Excellent reviews for these effector pathways are available; for detailed information, please see (Bishop and Hall, 2000; Symons and Settleman, 2000; Bokoch, 2003; Ridley, 2001; Yoshimi et al., 2001; Riento and Ridley, 2003).] Other Rho family proteins are not included but readers are referred to a recent review (Wennerberg and Der, 2004). Protein kinase N1 (PKN1, also known as PRK) and PKN2 are Rho effectors involved in endosomal trafficking. Citron is a ROCK-related kinase that is critical for cytokinesis and is also implicated in other aspects of cell cycle progression. Mammalian diaphanous protein 1 (mDia1, also known as dia-related formin or DRF), mDia2 and mDia3 mediate both actin polymerization through a profilin-dependent mechanism and stabilization of microtubule plus ends in cell migration. Rho kinase 1 (also known as ROCK1) and ROCK2 are key Rho effectors that have multiple substrates. A partial list includes the myosin-binding subunit of the myosin phosphatase (MBS), which leads to inhibition of phosphatase activity, increased myosin light chain phosphorylation and hence increased tension generation; LIM kinase (LIMK), which phosphorylates cofilin to release actin monomers and promote actin polymerization; and myosin regulatory light chain itself, which again promotes contractility. Rho kinase phosphorylates ezrin-radixin-moesin (ERM) family proteins to activate their function as linkers between actin and the plasma membrane. Rho kinases also phosphorylate the Na/H + antiporter NHE-1 to promote actin-membrane interactions and several intermediate filament proteins (desmin, vimentin and glial fibrillary acidic protein) to regulate intermediate filament structure. Both Rac and Rho bind to phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase (PIP5K); activation of PIP5K by Rho also requires Rho kinases. Production of phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate [PtdIns(4,5)P 2 ] contributes to the activation of ERM proteins and to actin polymerization through WASP, profilin and multiple actin-capping proteins. Other reported substrates for Rho kinases that are not pictured include MARCKS, EF-1, calponin, CPI-17 and collapsin-response mediator protein 2. Rac has numerous effectors that mediate effects on the cytoskeleton and gene expression. Rac binds p67 PHOX to increase activation of the NADPH oxidase system and production of reactive oxygen species (ROS), which mediate activation of NF-B-dependent gene expression, effects of Rac on cell cycle progression and inhibition of Rho activity. Rac binds the WAVE complex (also containing Abi and IRSp53/58), to release active WAVE, which promotes actin polymerization in lamellipodia through activation of the Arp2/3 complex. Both Rac and Cdc42 bind and activate the kinases PAK1, PAK2 and PAK3. PAKs have multiple substrates, including LIM kinase, which leads to actin polymerization; OP18/stathmin, which stabilizes microtubule plus ends; and Raf-1 and MEK1, whose phosphorylation by PAK enhances transmission of the signal to ERK. PAK activity also regulates myosin phosphorylation and cell contractility through several pathways, including myosin light chain kinase, myosin regulatory light chain, myosin heavy chain and caldesmon. Other pathways not listed on the diagram include filamin A, which cooperates with PAK to promote membrane ruffling; components of the paxillin-GIT/PKL-P1X complex, which regulates cell adhesion and motility; and the apoptotic regulator BAD, which promotes cell survival. Rac and Cdc42 are important activators of Jun N-terminal kinase (JNK) and p38, which stimulate AP-1-dependent gene expression. Mixed lineage kinases (MLKs) appear to be the major Rac/Cdc42 effectors leading to JNK and p38 activity. Rac and Cdc42 also bind to the actin-binding protein IQGAP, which is implicated in regulation of cell-cell adhesion. Both Rac and Cdc42 also bind and stimulate PI 3-kinase. The resultant 3'-phosphorylated lipids bind to and stimulate Rac GEFs, creating a positive feedback loop that maintains cell migration. WASP (and the more widely expressed N-WASP) are critical downstream effectors of Cdc42 that mediate formation of filopodia. These effectors also require PtdIns(4,5)P 2 and interact directly with Arp2/3 complex to promote actin polymerization. Cdc42 activates the serine/threonine kinase MRCK, which is related to Rho kinases and can promote myosin phosphorylation. Cdc42 also activates the tyrosine kinases ACK1 and ACK2; the latter regulates focal adhesion formation and organization of the actin cytoskeleton. Cdc42 promotes oncogenic transformation in part by binding to the and coatamer proteins and regulating membrane trafficking. Finally, Cdc42 is the critical determinant of polarity in a wide variety of developmental systems; this involves binding of Cdc42 to PAR6. PAR6 is a component of a complex containing PAR3 and atypical protein kinase C (PKC or PKC). This complex regulates positioning of the microtubule-organizing center (MTOC) in migrating cells and early embryos, and tight junction formation in epithelia. Borg proteins are Cdc42 effectors that connect to septins, structural proteins that can polymerize to form filaments involved in cytokinesis in yeast and mammalian cells, and that probably carry out additional structural roles in mammalian cells as well (Joberty et al., 2001). Finally, the poster displays some of the major feedback loops among Rho GTPases and their effector pathways. Formation of integrin-dependent cell-ECM adhesion formation, cadherin-dependent cell-cell adhesion formation and PI 3-kinase activation influence the function of GEFs and GAPs for Rho family GTPases. These positive and negative regulatory loops appear to be important for cell motility and perhaps other processes. Rho signalling at a glance J. Cell Sci 117, (2004) Martin Schwartz

154 154 Famille des protéines Rho Appartiennent à la super famille Ras 3 membres de la famille GTPases 1. Cdc42 : active WASp 2. Rac : active WASp (dans sa forme GTP) 3. Rho Agissent comme des interrupteurs moléculaires – Actif : liaison au GTP – Inactif : liaison au GDP

155 155 Fig. 3-70

156 156 Etienne-Manneville,S2002p629 Figure 1 The Rho GTPase cycle. Twenty mammalian Rho GTPases have been described: Rho (three isoforms: A, B, C); Rac (1, 2, 3); Cdc42; TC10; TCL; Chp (1, 2); RhoG; Rnd (1, 2, 3); RhoBTB (1, 2); RhoD; Rif; and TTF. They cycle between an active (GTP-bound) and an inactive (GDP-bound) conformation. In the active state, they interact with one of over 60 target proteins (effectors). The cycle is highly regulated by three classes of protein: in mammalian cells, around 60 guanine nucleotide exchange factors (GEFs) catalyse nucleotide exchange and mediate activation; more than 70 GTPase-activating proteins (GAPs) stimulate GTP hydrolysis, leading to inactivation; and four guanine nucleotide exchange inhibitors (GDIs) extract the inactive GTPase from membranes. All Rho GTPases are prenylated at their C terminus, and this is required for function. Rnd proteins are exceptional in that they do not hydrolyse GTP in vitro, which is an unusual property for a regulatory GTPase. It has been argued that they are controlled by expression, but it is equally possible that a yet to be identified GAP is required for hydrolysis. Le cycle de la GTPase Rho GDI : guanine nucleotide exchange inhibitors

157 Cdc42 Active WASp

158 Rac-GTP Active WASp Active PI(4)P-5 kinase Génère PI(4,5)P2 Dé - « capping » des filaments dont lextrémité + est liée à la gelsoline ou CapZ Plus de sites dassemblage à lactine près de la membrane plasmique Lamellipodes et ondulations

159 Rho-GTP Active une protéine kinase qui inhibe une phosphatase qui agit sur les chaînes légères de myosine Augmentation des chaînes légères de myosine phosphorylées Augmentation de lactivité contractile de la myosine Augmentation des fibres de stress

160 160 Fig A Illustration

161 161 Fig B Coloration négative en microscopie électronique de filaments de myosine II (plus courts que ceux que lon trouve dans la cellule musculaire striée) assemblés in vitro par phosphorylation de leurs chaînes légères

162 162 Membres de la famille WASp Conformation inactive repliée / active dépliée (comme ERM) Protéine WASp + cdc 42-GTP stabilisation de la forme ouverte liaison à ARP de lactivité de nucléation du complexe ARP Nucléation de lactine

163 163 Dynamique et organisation de lactine 1. Activation de cdc 42 – Polymérisation de lactine – Formation de faisceaux – Filopodes et spicules 2. Activation de rac – Polymérisation de lactine à la périphérie de la cellule – Lamellipodes et ondulations 3. Activation de rho – Formation de faisceaux dactine avec de la myosine II pour former des fibres de stress – Formation de contacts focaux par agglomération dintégrines et protéines associées

164 164 Mode daction de ces 3 « interrupteurs » Nombreuses protéines cibles en aval modifications de lorganisation et de la dynamique de lactine

165 165 Etienne-Manneville,S2002p629 Figure 1 The Rho GTPase cycle. Twenty mammalian Rho GTPases have been described: Rho (three isoforms: A, B, C); Rac (1, 2, 3); Cdc42; TC10; TCL; Chp (1, 2); RhoG; Rnd (1, 2, 3); RhoBTB (1, 2); RhoD; Rif; and TTF. They cycle between an active (GTP-bound) and an inactive (GDP-bound) conformation. In the active state, they interact with one of over 60 target proteins (effectors). The cycle is highly regulated by three classes of protein: in mammalian cells, around 60 guanine nucleotide exchange factors (GEFs) catalyse nucleotide exchange and mediate activation; more than 70 GTPase-activating proteins (GAPs) stimulate GTP hydrolysis, leading to inactivation; and four guanine nucleotide exchange inhibitors (GDIs) extract the inactive GTPase from membranes. All Rho GTPases are prenylated at their C terminus, and this is required for function. Rnd proteins are exceptional in that they do not hydrolyse GTP in vitro, which is an unusual property for a regulatory GTPase. It has been argued that they are controlled by expression, but it is equally possible that a yet to be identified GAP is required for hydrolysis. Les 3 membres de la famille Rho fonctionnent de façon semblable Activation par GEF (Guanine nucleotide Exchange Factor) (on en connaît plus de 20) Le cycle de la GTPase Rho

166 166 Fig16-50 Effets de Rho, Rac, et Cdc42 sur l'organisation de l'actine dans le fibroblaste (actine colorée à la pholloïdine fluorescente, contacts focaux colorés par AC anti vinculine) actine colorée à la phalloïdine fluorescente, contacts focaux colorés par AC anti-vinculine Nombreuses fibres de stress et contacts focaux Énorme lamellipode qui fait le tour de la celluleNombreux filopodes en périphérie

167 167 Alan Hall Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton Science, Vol 279, Issue 5350, 23 january 1998, p 509 Fig. 1. Rho, Rac, and Cdc42 control the assembly and organization of the actin cytoskeleton. Quiescent, serum-starved Swiss 3T3 fibroblasts (-) contain very few organized actin filaments (A) or vinculincontaining integrin adhesion complexes (B). The effects of Rho, Rac, or Cdc42 activation in these cells can be observed in several different ways such as with the addition of extracellular growth factors, microinjection of activated GTPases, or microinjection of guanosine diphosphate (GDP)–guanosine triphosphate (GTP) exchange factors. Addition of the growth factor lysophosphatidic acid activates Rho, which leads to stress fiber (C) and focal adhesion formation (D). Microinjection of constitutively active Rac induces lamellipodia (E) and associated adhesion complexes (F). Microinjection of FGD1, an exchange factor for Cdc42, leads to formation of filopodia (G) and the associated adhesion complexes (H). Cdc42 activates Rac; hence, filopodia are intimately associated with lamellipodia, as shown in (G). In (A), (C), (E), and (G), actin filaments were visualized with rhodamine phalloidin; in (B), (D), (F ), and (H), the adhesion complexes were visualized with an antibody to vinculin. Scale: 1 cm 5 25 mm. [Figure courtesy of Kate Nobes]

168 168 Fig. 4. ERM proteins are required for GTPase-mediated cytoskeletal changes. It has been proposed that ERM proteins exist in a closed (inactive) conformation and an open (active) conformation. There is evidence to suggest that this transition can be regulated by Rho, perhaps through the activation of a Ser-Thr kinase or a lipid kinase (through PIP2). In the active conformation, the NH2-terminus of ERM proteins (pink) can interact with transmembrane proteins, such as CD44, whereas the COOH-terminus (blue) interacts with F-actin. This membrane–ERM–F- actin unit is an essential prerequisite for the Rho GTPases to induce cytoskeletal changes. In the case of Rho, this is likely to be mediated by the bundling and reorganization of preexisting actin-myosin filaments to generate stress fibers, whereas in the case of Rac and Cdc42 it is likely that preexisting filaments are uncapped to allow actin polymerization and filament growth leading to the formation of lamellipodia and filopodia. Alan Hall, Science, Vol 279, Issue 5350, 23 january 1998 p509 Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton

169 169 Alan Hall, Science, Vol 279, Issue 5350, 23 january 1998 p509 Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton Fig. 5. Cdc42p-associated signaling complexes in S. cerevisiae. Cdc42p is essential for both pheromone- induced mating and for nitrogen starvation–induced filamentous growth. In the pheromone response, Bem1p acts a scaffold protein and interacts with Cdc24p (an exchange factor for Cdc42p), Far1p (a cell cycle inhibitor), actin, Ste20p (a Ser- Thr kinase that can interact with Cdc42p), and Ste5p. Ste5p is a scaffold protein that interacts with components of a MAP kinase cascade. Ste20p activates the MAP kinase cascade, but no interaction with Cdc42p is required. A role of Cdc42p is to localize this signaling complex to the mating projection. Cdc42p and Ste20p are also required to activate a distinct MAP kinase pathway (still not completely defined) in response to nitrogen starvation. In this case, the interaction between Cdc42p and Ste20p is essential.


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