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Identification de la mutation Jak2V617F dans les syndromes myeloprolifératifs F.harieche, N.Abdennebi, F.Boukhemia, F.Zerhouni, R.M.Hamladji.

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1 Identification de la mutation Jak2V617F dans les syndromes myeloprolifératifs F.harieche, N.Abdennebi, F.Boukhemia, F.Zerhouni, R.M.Hamladji.

2 Syndromes myeloprolifératifs Similitudes cliniques et biologiques Origine commune: CSH hyperplasie myéloïde globale hypersensibilité voire indépendance des progéniteurs hématopoeitiques aux facteurs de croissance. Classification OMS: semi moléculaire SMP classiques: SMP BCR-ABL+: LMC SMP BCR-ABL neg: P.V, TE, MFP SMP atypiques leucémie neutrophile chroniq mastocytose systémique leucémie éosinophile chroniq SHE Jak2 V617F

3 Mutation Jak2V617F…? Jak2: famille Janus kinases (Jak1,Jak2,jak3,Tyk2) TK associée R-EPO, MPL, R-G-CSF Fonction: régulation de l`expression des gènes en réponse aux cytokines. migration vers le noyau CASCADE DE SIGNAUX DE PROLIFERATION: Jak-STAT

4 Mutation Jak2V617F Gène cloné 1989: 9p24 Mutation JH2 Substitution G……T nt 1849 Changement Val…..Phe au codon 617 Jak2 V617F Mutation acquise, unique,clonale CSH: cellules myéloïdes (PN, EB, pqt) Absente des Ly T Jak2 muté: pas d`inhibition par le domaine JH2 activité kinase constitutivement active, indépendante de la fixation du ligand sur son récepteur….activation signaux en aval. Structure des tyrosine kinases Jak KB JH1 JH2 FERMSH2 domaine pseudo Kinase Src homology 2 domaine Kinase YY R-EPO interacting domain

5 Jak2 et oncogenèse Protéines de fusion: SMP atypiques : t(8;9)(p21;p24)PCM1-JAK2 t(9;12)(p24;p13)JAK2-ETV6 t(9;22)(p24;q11.2)JAK2-BCR Perte du domaine de fixation aux récepteurs de cytokines (FERM) pas de gain de fonction !!!

6 Fréquence de la mutation JAK2 AuteurPVTEMF Kralovics 65%(27%) n=128 23%(3%) n=93 57%(22%) n=23 James 89%(30%) n=45 43% n=21 43% n=7 Levine 74% (25%) n=164 32% (3%) n=115 35%(9%) n=46 Baxter 97%(26%) n=73 57%(0%) n=51 50%(19%) n=16 Différences de fréquences: Stringence des critères de diagnostic de PV, La sensibilité des méthodes de détection de la mutation, La source de l`ADN (PN..!!!)

7 Méthodes de détection AuteurRéférenceMéthodeCellules KralovicsNEJMSéquencagePN JamesNatureSéquencagePN Levinecancer cellSéquencagePN BaxterLancetAS-PCRPN JonesBloodAS-PCRSang total Mc ClureLeukemia AS-PCR Melting curve assay PN PassamontiBloodReal time AS-PCRPN LevineBlood mai 2006Q-PCRPN

8 Patients (n=59) SMP Ph- (n=45) SMP? (n=14) Total (n=59) PV16 (35.5%)-16 (27%) TE23 (51%)-23 (39%) MFP6 (13%)-6 (10%) Budd-Chiari-8 (57.14)8 (13.5%) Suivi médian(an)3 [1 - 9]-3 [1 – 9] Age (médiane)48 [24 – 75]33 [30 – 60]48 [ ] Sexe ratio (h/f)18/27 (0.66)5/8 (0.62)23/34 (0.7) Fev 2010 – mars (37%) Patients traités HU; …….. BCR-ABL neg.

9 Échantillons biologiques Sang total: EDTA 0.34M PN+++: Ficoll+lyse totale GR 3 étapes: Extraction d`ADN (Qiagen TM )…..10ng/ul Amplification: PCR: Seeplex Jak2 genotyping Kit. « primers DPO » - Gène sauvage (WT) - Gène muté 35 cycles Visualisation des produits de PCR (E-se gel d`agarose à 2% +BET)…..UV 800pb (contrôle int) 600pb (non muté) 300pb (muté)

10 Résultats: SMP Ph- (n=45) SMP? (n=14) Total (n=59) PV (n=16) 11 (68.75%)-11 (18.6%) TE (n=23) 3 (13%)-3 (5%) MFP (n=6) 1 (16.6%)-1 (1.7%) Budd-Chiari (n=8) -3 (37.5%)3 (13.5%) Total15 (33.3%)3 (21.4%)18 (30.5%)

11 Résultats Mutations à l`état hétérozygote: 2 situations: Allèle muté +allèle WT PN normaux PN malins

12 Commentaires 3 implications: Affirmer le diagnostic de SMP au même titre que BCR-ABL, 1er examen à effectuer devant: Polyglobulie,.évaluation initiale + EPO sérique. (critère majeur) Thrombocytose, Hyperleucocytose d`étiologie non évidente. Budd-Chiari (thromboses révélatrices de SMP) Rapport Jak2V817F/Jak2WT dans les PN: élément pronostique évolution vers myelofibrose TE,PV Développer thérapeutiques de type ITK: ciblées Jak2 muté.

13 PCR Spécifique, sensible Reproductible Multiplex: coamplification des 2 allèles Jak2 (sauvage et muté) ………… 1 seule étape Rapide: 1 jour (5 heures). Contrôle interne d`amplification (intégrité ADN: reprentativité) Marqueur de taille intégré. Mais: Faux négatifs: Coexistance de PN issus de CSH non mutée et PN issus de CSH mutée. Nature du matériel cellulaire testé (lyse cellulaire) traitements antérieurs: diminution de la charge de l`allèle muté.


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