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Méthodes moléculaires en Microbiologie M1 nutraceutique UE9 Gestion du risque microbiologique 4 mars 2009 Emmanuel BERTRAND.

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1 Méthodes moléculaires en Microbiologie M1 nutraceutique UE9 Gestion du risque microbiologique 4 mars 2009 Emmanuel BERTRAND

2 Besoins Contraintes industrielles Marché de lanalyse Microbiologique Intérêt des outils de biologie moléculaire Méthodes moléculaires Exemples : Secteur Agro-alimentaire : Détection Secteur Pharmaceutique/Cosmétique : Identification Secteur environnement : Quantification Secteur vétérinaire : Screening Autres technologies Plan

3 1- Besoins A chaque secteur dactivité correspond une demande particulière. - Secteur Agro-alimentaire : Détection - Secteur Pharmaceutique/Cosmétique : Identification - Secteur environnement : Détection et Quantification - Secteur vétérinaire : Screening et Détection

4 1- Besoins – Secteur Agro-alimentaire Détection (ex. Listeria monocytogenes, Salmonella, E. coli O157:H7,…) - Savoir si le produit est propre à la consommation - Besoin davoir un résultat le plus rapidement possible - Utiliser des outils accrédités - Méthodes standardisées pour tous types de matrices et de pathogènes - Coûts danalyse < 5 (PCR) et < 1 (Bactériologie classique)

5 Présence et Identification - Savoir si le produit contient des micro-organismes - Déterminer le genre et lespèce du contaminant - Pas de contraintes de temps danalyse - Utilisation de systèmes internes et commerciaux dans un cadre normatif - Coûts danalyse > Besoins – Secteur Pharma/Cosmétique

6 Détection et quantification - Recherche dun genre et/ou dune espèce - Quantifier la flore recherche - Contraintes de temps danalyse (pb Santé publique) - Utilisation de systèmes internes et commerciaux dans un cadre normatif - Coûts danalyse = Besoins – Secteur Environnement

7 Détection et Screening - Recherche dune espèce et/ou identification du sérotype - Contraintes de temps danalyse (pb Santé publique) - Utilisation de systèmes internes et commerciaux dans un cadre normatif - Coûts danalyse = Besoins – Secteur Vétérinaire

8 2- Contraintes industrielles Risque sanitaire potentiellement élevé en raison des volumes produits Une crise sanitaire = Coûts élevés voir une fermeture de site Le coût danalyse est fonction du PRI du produit Le temps danalyse (TTR) est déterminé par la durée de vie du produit et les coûts de stockage En fonction des secteurs dactivité, les niveaux dexpertise sont très disparates. Agroalimentaire < Vétérinaire < Pharma/Cosmétique

9 2- Contraintes industrielles - Matrices Les outils doivent être adaptés pour une large gamme de matrices - Agroalimentaire : Produits carnés, ovo produits, produits laitiers, produits de la mer, végétaux, … - Pharma/Cosmétique : Poudres, détergents, principes actifs, … - Environnement : Eaux, air, surfaces, … - Vétérinaire : Sang, organes, fèces, urines, … Implique : - Robustesse vis-à-vis des agents inhibiteurs de PCR contenus dans les matrices (sels, détergents, phénol, matières grasses, colorants, nombreux facteurs protéiques, antibiotiques, …) - Protocoles adaptés aux différents types de matrices (Liquides, solides, gazeuses, …)

10 Prises dessais standardisées ? - 25g de matrices (Matrices alimentaires) - 100mL à 1L de liquide (Matrices environnementales) - Véto: adaptées en fonction du statut de linfection (sang, organes, urines, lait, …) - Pharma/cosméto : adaptées en fonction de létat physique de la matrice et des normes internationales Lenrichissement est nécessaire en dehors dun statut dinfection (à lexception des eaux). 2- Contraintes industrielles – Prises dessais

11 1- Marché de lanalyse microbiologique 801 M$ 109 M tests Volume et valeur marché global

12 Sur le plan mondial les méthodes immunoassay (PDM 35%) sont devant la PCR (PDM 10% = 15M tests) 1- Marché de lanalyse microbiologique Méthodes utilisées sur le marché mondial

13 Pathogènes 2005 Pathogènes 2010 Méthode traditionelle 62Mtest (56,5%) Immunoassay 37,8Mtest (34,4%) PCR 10Mtest (9,2%) Easy Hard FastSlow Easy Hard FastSlow Méthode traditionelle 64,7Mtest (44%) Immunoassay 57,3Mtest (39,4%) PCR 25Mtest (17,1%) 110M tests 1- Marché de lanalyse microbiologique Croissance mondiale PCR +150% de 2005 à 2010

14 Tendance et demande marché sur Diagnostic microbiology Food Performance désirée En 2000 = sensibilité méthode et robustesse Depuis 2005 Rapidité des tests (83%) tendance TTR 24h Reconnaissance méthode Diminution des coûts par test Augmentation du nombre de tests (pression client et réglementaire) Tendance future 2010 Reconnaissance méthode Ultra Rapidité des tests tendance TTR <24h, 8h Diminution des coûts par test Simplification méthode 1- Marché de lanalyse microbiologique

15 2- Intérêts des outils de biologie moléculaire Avantages : - Sensibilité > méthodes traditionnelles - Spécificité - TTR (Time to result) < méthodes traditionnelles - Automatisation possible Inconvénients : - Coûts - Praticabilité - Robustesse

16 2- Intérêts des outils de biologie moléculaire Utilisation actuelle : - Diagnostic durgence, de libération - Suivis de site (TAR, surface,…) - Suivi du produit dans son process de fabrication - Identification bactérienne Utilisation souhaitée : - Analyses de routine

17 2- Intérêts des outils de biologie moléculaire

18 amorce 40 cycles B) Amplification du signal A) Spécificité du signal gène cible A) Trouver "une aiguille dans une botte de foin". B) Photocopieuse à ADN. Pour 1 copie initiale on obtient en fin de PCR k.2 n copies au final = copies 2- Intérêts des outils de biologie moléculaire

19 3- Méthodes moléculaires PCR Temps réel (vs PCR classique) Détection Quantification Suivi Marchés : Agroalimentaire et environnement Identification (PCRs, Séquençage, Puces,…) Marchés : Pharmaceutique et cosmétique

20 PCR conventionnelle versus PCR quantitative + ++ PCR conventionnelle PCR quantitative Pièce n°1Pièce n°2 3- Méthodes moléculaires – Détection

21 PCR conventionnelle versus PCR quantitative Le résultat : PCR conventionnelle PCR quantitative M A B C PV automatique - Sauvegarde informatique de lanalyse et du résultat Méthodes moléculaires – Détection

22 La PCR quantitative Il existe plusieurs types de marquage - Marquage non spécifique - Marquage spécifique - sondes dhydrolyse - sondes dhybridation 3- Méthodes moléculaires – Détection

23 - Le choix des chimies seffectue en fonction : - des licences - du coût - de lapplication 3- Méthodes moléculaires – Détection

24 Marquage non spécifique La chimie SyBr Green® -Marquage non spécifique de lADN double brin - Augmentation du signal x1000 quand la molécule est liée -Produit par Molecular Probe -Possibilité réduite pour faire du multiplexage 3- Méthodes moléculaires – Détection

25 Colorants non spécifiques Se lient à lADN double brin (au niveau du petit sillon) Ne fixe pas lADN monobrin –SYBR Green (x10,x25 plus sensible que le BET) –Bromure déthidium Souvent utilisé pour les courbes de fusion Intercalants de lADN 3- Méthodes moléculaires – Détection

26 Les sondes dhydrolyse Les sondes dhybridation Les amorces fluorescentes Importance du moment de lenregistrement du signal Les sondes marquées 3- Méthodes moléculaires – Détection

27 Les sondes marquées R « Reporter »« Quencher » Q nm Absorbtion Fluorescence R = FAM nm Absorbtion Fluorescence Q = TAMRA 3- Méthodes moléculaires – Détection

28 Les sondes marquées RQ Eloignement Lyse R Q « Quenching » Q R 3- Méthodes moléculaires – Détection

29 Utilisation dune Taq polymerase avec une activité exonucléasique La sonde shybride avec la cible La polymerase clive la sonde Le reporter est éloigné du quencher et lon observe une augmentation du signal. Système Taqman® 3- Méthodes moléculaires – Détection

30 Technologie des sondesTaqMan® MGB - MGB : Minor Groove Binder - Sonde courte, Tm élevé 3- Méthodes moléculaires – Détection

31 Technologie des sondes LNA LNA : Locked Nucleic Acids Bases nucléotidiques modifiées. Présence dun groupement méthylène Augmentation du Tm Utilisés pour : –Taqman –FRET –Molecular Beacons 3- Méthodes moléculaires – Détection

32 Configuration en épingle à cheveu Hybridation avec la cible pendant la phase délongation Le reporter est éloigné du quencher et lon observe une augmentation du signal Utilisés dans les kits IQ- Check, ADIAFood,… Molecular beacons 3- Méthodes moléculaires – Détection

33 Fluorescent Resonance Energy Transfer Utilise deux sondes marquées Lénergie est transferrée entre les deux sondes marquées Technologie Roche FRET 3- Méthodes moléculaires – Détection

34 Scorpions ® 3- Méthodes moléculaires – Détection

35 Scorpions ® 3- Méthodes moléculaires – Détection

36 Quantification absolue -Quantification avec une gamme étalon. -Sur un même run PCR on analyse léchantillon en même temps que la gamme étalon. -Pour plus de justesse, létalon doit être de même nature (ADN génomique, plasmide, ARN, …) que la cible. 3- Méthodes moléculaires – Quantification

37 Quantification absolue Equation de la gamme étalon : y = Log(X) Le Ct de léchantillon est de soit copies initialement présentes dans léchantillon. La quantité peut être massique ou en copie, UG (unité génomique)… Méthodes moléculaires – Quantification

38 Lidentification 3- Méthodes moléculaires – Identification

39 Les techniques dérivées de la PCR Nested PCR -1 ère PCR « consensus » du gène cible (ex. Genre) -2 ème PCR « spécifique » de la cible recherchée (ex. Espèce) -Augmentation de la sensibilité -Risque de contamination 3- Méthodes moléculaires - Identification

40 PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) -Utilisation du polymorphisme des sites de restriction Listeria monocytogenes Listeria ivanovii Escherichia coli O157H7 BglII BamHI SalI BamHI BglIIBamHI SalI HindIII BglII + BamHI BglII + SalI Produit de PCR Les techniques dérivées de la PCR 3- Méthodes moléculaires - Identification

41 Multiplex PCR M. synoviae (FAM) M. gallisepticum (Cy5) IPC (HEX) Exemple : Triplex Mycoplasmes aviaires (ADIAVET) Ce système permet lamplification de plusieurs cibles dans un même tube réactionnel. Le mix comprend : -1 à plusieurs jeux damorces -Une sonde par cible -Attention aux compétitions et au choix des fluorophores Les techniques dérivées de la PCR 3- Méthodes moléculaires - Identification

42 PCR RAPD Polymorphisme damplification des génomes Individu A Individu B Les techniques dérivées de la PCR 3- Méthodes moléculaires - Identification

43 Le séquençage 3- Méthodes moléculaires - Identification - Séquençage automatisé - Haut débit - Niveau dexpertise moyen - Equipement lourd - Utilisé par le Pharma/Cosméto/Prestataires de service

44 Le séquençage 3- Méthodes moléculaires - Identification Préparation de léchantillon Enrichissement Isolement

45 Le Pyroséquençage 3- Méthodes moléculaires - Identification Biotage Préparation de léchantillon Enrichissement Isolement - Faible débit danalyse - Niveau dexpertise moyen - Coûts moyens - Utilisé par le Pharma/LNR/Prestataires de service

46 3- Méthodes moléculaires - Identification Le Pyroséquençage

47 3- Méthodes moléculaires - Identification Les puces

48 Les puces : Macroarray (Faible débit) 3- Méthodes moléculaires - Identification - Matériel de base - Niveau dexpertise moyen - Utilisée par certains LVD et LNR - Taille des spots : 100µm à spots/cm² - Colorimétrie ou fluorescence Préparation de léchantillon Enrichissement facultatif Extraction et purification Reverse Transcription Analyse sur puce

49 Les puces : Microarray spottée (Haut débit) 3- Méthodes moléculaires - Identification - Equipement lourd - Niveau dexpertise élevé - Qqs Laboratoires prestataires maîtrisent cet outil - Taille des spots : 100µm à spots/cm² - Fluorescence Préparation de léchantillon Enrichissement facultatif Extraction et purification Reverse Transcription Analyse sur puce

50 Les puces : GeneChips Affimetrix Préparation de léchantillon Enrichissement facultatif Extraction et purification Reverse Transcription Analyse sur puce 3- Méthodes moléculaires - Identification - Equipement lourd - Niveau dexpertise élevé - Taille des spots : 20µm spots/cm² - Fluorescence

51 - Risques de contamination - Risques dinhibitions Faux positifs Faux négatifs 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR

52 Les faux positifs -Peuvent intervenir à tous les stades de la PCR : -Préparation de léchantillon -Préparation du mélange pré-PCR -Ajout de léchantillon 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR

53 ADN amplifié : quel risque ? 100 µl de produits amplifiés = copies dADN Bassin olympique (50 x 25 x2) 100 µl = 400 copies dADN 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR

54 Les contaminations inter échantillons - Lors de la préparation des échantillons - Lors de la détection 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR

55 Comment décontaminer ? 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR -Isopsoralen -U.V. -Eau de javel -Produits commerciaux -Système Uracyl-N-Glycosylase / dUTP

56 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR Comment décontaminer ? Par Irradiation

57 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR Comment décontaminer ? Inactivation par utilisation de lUNG

58 Les faux positifs : les contrôles -Lors de la préparation de léchantillon (lyse cellulaire) : contrôle négatif dextraction -Lors de la préparation du mélange damplification : contrôle négatif damplification Absence de faux positifs 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR

59 Les faux négatifs Origines -Erreur dans le mélange pré-PCR ou dysfonctionnement du thermocycleur - Présence dinhibiteurs dans léchantillon Solutions -Contrôle positif damplification - Contrôle interne damplification Absence de faux négatifs 3- Méthodes moléculaires – Les limites de la PCR

60 Le contrôle interne -Un contrôle interne est une molécule dADN ou dARN qui va être amplifié en même temps que la cible recherchée -contrôle interne damplification -contrôle interne de purification -contrôle interne dextraction 3- Méthodes moléculaires - IPC

61 Le contrôle interne 3- Méthodes moléculaires - IPC IPCTypeMoment d'ajoutContrôle Contrôle interne d'amplification ADN génomique, Plasmide, Nucléotide Présent dans le mix PCR Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR Contrôle interne de purification ADN génomique, Plasmide, Nucléotide Ajouter lors de l'étape de lyse ou de purification Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR, de l'absence de dégradation d'ADN, de l'absence de perte lors de la purification Contrôle interne d'extraction ADN de l'échantillon (Cellules hôtes, tissus,…) Contenu dans l'échantillon Contrôle de l'inhibition de la réaction de PCR, de l'absence de dégradation d'ADN, de l'absence de perte lors de la purification, de l'efficacité de lyse sur l'échantillon.

62 Le contrôle interne : Construction 3- Méthodes moléculaires - IPC la molécule d ADN cible Modification de la molécule d ADN cible Co-amplification des deux molécules avec les mêmes amorces Mélange PCRHybridationAmplification

63 Le contrôle interne : Construction (2) 3- Méthodes moléculaires - IPC

64 3- Méthodes moléculaires - Compétition Compétition Contrôle interne 500 pb Cible PCR 221 pb Quantité constante de contrôle interne = 2000 molécules Quantité croissance de bactéries de 0 à

65 3- Méthodes moléculaires - Compétition Compétition Cas dune PCR où la cible et lIPC sont co-amplifiés avec le même couple damorces mais une sonde différente. Cible marquée en FAMIPC marqué en VIC

66 3- Méthodes moléculaires - Normalisation R : sans normalisation dRn : avec normalisation Signal fluorescent normalisé par une référence fluorescente passive

67 3- Méthodes moléculaires - Normalisation Fam ROX Fluorescence Echantillon 1 RnRn RnRn Fam ROX Echantillon 2 Fluorescence reporter (Fam) Référence passive (Rox) Rn =

68 3- Méthodes moléculaires - Normalisation Intérêt de la normalisation : -Harmonisation pour le positionnement du Threshold -Quantification absolue et relative

69 4- Exemples – Secteur Agroalimentaire - Recherche de E. coli O157:H7 en viande hachée - Seuil de détection 1 UFC/25g matrice Production TransformationDistribution Consommation 2 – 10 jours 5 – 10 jours (temps de maturation)

70 4- Exemples – Secteur Agroalimentaire Enrichissement 1CFU dans 25g PCR Croissance sélective Enrichissement 2h30 1 jour 8h Etape 1 Enrichissement Etape 2 Extraction dADN Etape 3 Amplification ADN & analyse

71 4- Exemples – Secteur Agroalimentaire Collecte de léchantillon (25g) Broyage Milieu denrichissement (225mL) Incubation (8h) 25 g Etape 1 : ENRICHISSEMENT

72 Etape 2 : EXTRACTION 4- Exemples – Secteur Agroalimentaire Lyse thermique (10 à 30 minutes 95°C) Lyse physique : Broyage, sonication, … Lyse chimique avec détergents ou résines (avec ou non une incubation) Lyse enzymatique (Protéinase K, Lysozyme,…) avec une étape dincubation Le choix de la lyse : en fonction du pathogène recherché Pour certains pathogènes, on a recours à différentes méthodes de lyse Des étapes de clarification et de concentration peuvent être ajoutées en fonction de la matrice et de la vitesse de croissance bactérienne

73 Prélèvement de 1ml de bouillon Centrifugation 2min à 500g Prélever 500µL du surnageant Eliminer le surnageantReprendre le culot dans 100µL Tp lyse Utilisation de tubes au format Exemples – Secteur Agroalimentaire Etape 2 : EXTRACTION Centrifugation 5min à 5000g

74 Mix PCR Distribution (15µL) Transfert 10µL ADN extrait Etape 3 : DETECTION 4- Exemples – Secteur Agroalimentaire

75 Etape 4 : Analyse En dehors dexpertise dans les IAA, lanalyse des données ne doit pas être fonction du facteur humain.

76 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto - Recherche de germes dans une crème de soin - Altération du produit - Santé du consommateur

77 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto Dilution au 1/10 en milieu liquide Etape 1 : ENRICHISSEMENT Incubation (24h)

78 Etape 2 : Filtration 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto Filtration de 10 à 100mL sur membrane (porosité de 0.45µm)

79 Etape 3 : Extraction et purification Récupération des cellules collectées sur la membrane Lyse à laide dautomate Purification sur colonne de Silice 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto

80 Etape 4 : Amplification Préparation des mix PCR en automate Amplification de lADN extrait avec des amorces universelles pour Eucaryotes et Procaryotes (16S, 23S, …). Détection par électrophorèse ou par fluorescence non spécifique (SybrGreen) Si présence

81 Etape 5 : Séquençage Préparation des mix PCR avec Dyes pour le séquençage Amplification et détectionObtention du spectre 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto

82 Etape 6 : Analyse de séquence 4- Exemples – Secteur Pharma/Cosméto Extraction de la séquenceInterrogation des banques de données Identification

83 4- Exemples – Secteur Environnement - Détection Legionella pneumophila et Quantification de Legionella spp - Legionella spp est un indicateur de présence de Legionella pneumophila - La présence de L. pneumophila entraine une action curative immédiate - Réglementation sur la quantité de L. spp / Litre - si < 1000 UFC/litre = pas daction - si compris entre 1000 et UFC/litre = Action curative - si > UFC/litre = fermeture du site

84 Prélèvement Filtration de 100mL à 1L sur membrane (porosité de 0.45µm) 4- Exemples – Secteur Environnement

85 1ml Tampon de lyse LB Ajouter la membrane pliée Incubation 20 min à 95°C Vortexer 15s Laisser à T° ambiante Déposer 550µl de lysat dans la colonne « Cleaning unit » Centrifugatio n 3 min à 7000g 1 ère Etape : Lyse 2 ème Etape : Clarification

86 Déposer 500µl de filtrat dans la colonne Centrifugation 5 min à 7000g Ultrafiltration Lavage 200µL de Tampon CB1 Centrifugation 5 min à 7000g Compléter à 100µl avec le Tampon CB2 Stocker à +4°C ou à - 20°C Lavage 200µL de Tampon CB1 Centrifugation 5 min à 7000g 3 ème Etape : Purification et Concentration 4- Exemples – Secteur Environnement

87 Réalisation dune gamme étalon dADN génomique de L. pneumophila Run PCR avec en parallèle la gamme et les échantillons

88 4- Exemples – Secteur Vétérinaire

89 Diagnostique de la Fièvre Catarrhale Ovine Recherche du virus (Sentinelle) Identification du sérotype (Campagne de vaccination) Novembre 2007Novembre 2008

90 Préparation du prélèvement (Sang sur EDTA) Extraction et purification de lARN PCR avec Mix de Groupe Si léchantillon est positif en Groupe, il faut alors le typer PCR avec Mix de Type Détermination du sérotype

91 5- Autres technologies Cibles : Génome Transcriptome Protéome Phénotype

92 5- Autres technologies Cytométrie en flux : sur la cellule entière Marqueurs de viabilité (substrats couplés à des fluorophores : FITC, …) Marqueurs spécifiques par germe recherché (Recherche par AC marqués) Très rapide Coûts élevés

93 5- Autres technologies Puces à Protéines, Peptides, Anticorps Principe basé sur le test ELISA Marqueurs spécifiques par germe recherché (Recherche par AC marqués) Rapide Coûts fonction du nombre de spots

94 5- Autres technologies Spectromètrie de masse Reconnaissance en partie du Protéome Avec ou sans électrophorèse 2D Analyse de spectres En vogue Coûts élevés

95 5- Autres technologies Biolog : Analyse du phénotype Reconnaissance par le métabolisme Plaques 96 contenant différentes sources (sucres, sulfates, …)


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