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TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE. 2 Moyens de communication de la cellule avec l'environnement Procaryotes –Tout passe par la membrane plasmique Eucaryotes.

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1 TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE

2 2 Moyens de communication de la cellule avec l'environnement Procaryotes –Tout passe par la membrane plasmique Eucaryotes –Endocytose milieu extra cellulaire lysosomes digestion métabolites dans le cytosol –Exocytose : voie sécrétoire synthèse de nouvelles molécules compartiments surface

3 3 Fig 13-1 Les voies endocytaire et sécrétoire –voie endocytaire –voie sécrétoire –voies de retour

4 4 La lumière Espace compris à l'intérieur d'un compartiment limité par une membrane Topologiquement toutes équivalentes entre elles et avec l'espace extra cellulaire

5 5 Rôle de la voie endo/exo-cytaire Modification des molécules qui seront sécrétées vers l'extérieur Connections (indirecte) de la membrane plasmique au réticulum endoplasmique

6 6 Topologie des membranes Les lumières sont équivalentes Le transport se fait par vésicules

7 7 Le cargo Molécule luminale ou membranaire qui est transportée par la vésicule

8 8 Fig 13-2 Fusion des feuillets bleus Fusion des feuillets rouges Transport vésiculaire maintien de l'asymétrie de la membrane pas de membrane à traverser pour les molécules solubles

9 9 Fig 13-3 Voie sécrétrice Voie endocytaire Recirculation Golgi RE Endos tardif Golgi Endos précoce membrane Compartiments intracellulaires impliqués dans les voies endo/exo-cytaires

10 10 Équilibre entre les compartiments Entrées = sorties Pour les membranes et pour les cargos Un aller un retour Sélectivité –Des cargos transportés –Des destinations

11 11 TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE I.Les mécanismes moléculaires du transport par membrane et le maintien de la diversité des compartiments II.Transport à partir du réticulum endoplasmique à travers le Golgi III.Transport du TGN vers les lysosomes IV.Transport de la membrane plasmique vers l'intérieur de la cellule : endocytose V.Transport du TGN vers l'extérieur de la cellule : exocytose

12 12 TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA CELLULAIRE I - Les mécanismes moléculaires du transport membranaire et le maintien de la diversité des compartiments Phénomènes de bourgeonnement et fusion Maintien des différences entre les compartiments

13 13 Problème Échange permanent entre les compartiments mélange des molécules tous les compartiments finiront pas être identiques

14 14 La solution Marqueurs moléculaires exprimés à la surface cytosolique des membranes

15 15 Méthodes d'approche Systèmes sans cellules Protéines de fusion avec la GFP Génétique

16 16 Systèmes sans cellules Population donneuse –cellules mutantes qui n'ont pas N-acétylglucosamine transférase I –infectées par un virus (donc glycoprotéine virale présente) –pas de glycoprotéine virale porteuse de N-acétylglucosamine Golgi accepteur –possède N-acétylglucosamine transférase I (type sauvage) –non infecté par le virus donc pas de glycoprotéine virale Mélange des deux –présence de glycoprotéine virale porteuse de N-acétylglucosamine Il a fallu qu'il y ait transport

17 17 Protéines de fusion avec la GFP

18 18 Génétique Protéines thermosensibles codées par des mutants Phénomène de suppression multicopies

19 19 Éléments d'approche 1.Les types de vésicules 2.Assemblage du manteau (les GTPases) 3.Guidage du transport (les SNARE) 4.Amarrage (protéines Rab) 5.Fusion

20 20 Éléments d'approche 1.Les types de vésicules 2.Assemblage du manteau (les GTPases) 3.Guidage du transport (les SNARE) 4.Amarrage (protéines Rab) 5.Fusion

21 Les types de vésicules Vésicules recouvertes sur leur face cytosolique Bourgeonnement Perte du manteau Fusion des membranes

22 22 Les deux rôles du manteau Concentration de protéines membranaires dans un patch qui formera la vésicule permet la sélection des molécules à transporter Moule la vésicule qui aura ainsi toujours à peu près la même taille

23 23 Les trois types de manteau des vésicules recouvertes Clathrine COPI COPII

24 24 Fig 13-4 Les trois types de manteau des vésicules recouvertes

25 25 Utilisation des différents manteaux dans le trafic vésiculaire Clathrine : à partir du Golgi et à partir de la membrane plasmique –au moins trois types de vésicules à clathrine COPI et COPII : à partir du RE et du Golgi Beaucoup d'autres

26 26 Fig 13-5 Utilisation des différents manteaux dans le traffic vésiculaire

27 27 Éléments d'approche 1.Les types de vésicules 2.Assemblage du manteau (les GTPases) 3.Guidage du transport (les SNARE) 4.Amarrage (protéines Rab) 5.Fusion

28 Assemblage du manteau a - Exemple : clathrine Le plus étudié (b - COPI et COPII)

29 29 Fig 13-6 Puits et vésicules recouverts de clathrine en congélation sublimation rapide

30 30 Clathrine Une sous-unité de clathrine = –3 grosses chaînes + –3 petites chaînes Une sous-unité = un triskélion Assemblage des triskélions en un panier d'hexagones et pentagones Triskélions peuvent s'assembler spontanément en panier même sans membrane

31 31 Fig 13-7 Manteau de clathrine (C) Cryo-électro- microphotographie (B) Deux triskélions chaînes lourdes en gris ou rouge chaînes légères en jaune (A) Ombrage au platine

32 32 Manteau de clathrine Un manteau = 36 triskélions (sans la vésicule) 12 pentagones + 6 hexagones Formation de deux coquilles –externe –interne : domaines N-terminaux des chaînes lourdes où se fixent les adaptines Sur une vésicle : 12 pentagones + beaucoup plus d'hexagones

33 33 Adaptine Protéine de manteau à clathrine Complexe multiprotéique Lie la clathrine à la membrane Piège les protéines transmembranaires dont les récepteurs qui capturent les cargos solubles Au moins 4 types d'adaptine pour les différents récepteurs de cargo

34 34 Fig 13-8 Assemblage et désassemblage d'un manteau de clathrine –Les adaptines se lient à la clathrine et au complexe cargo/cargo-r –Dynamine = GTPase

35 35 Pincement de la membrane Dynamine + autres protéines Fusion des feuillets non cytosoliques (grâce à la dynamine)

36 36 Fig 13-9 Rôle de la dynamine Puits à clathrine dans les cellules nerveuses de drosophiles shibire ayant une mutation du gène de la dynamine entraînant une paralysie. Anneau correspondant à la dynamine mutée

37 37 Perte du manteau La vésicule quitte la membrane Le manteau de clathrine est perdu immédiatement –intervention de chaperonne de la famille des hsp70 (ATPase) –auxilline active l'ATPase La vésicule doit attendre d'être constituée pour que le manteau se retire

38 38 Spécificité du manteau Mécanismes généraux identiques Mais chaque membrane a ses spécificités –membrane plasmique (riche en cholestérol) : nécessité de beaucoup d'énergie –autres membranes : existence de bourgeonnements

39 39 b - Protéines autres que la clathrine CopI : 7 sous-unités protéiques analogies avec adaptine –Bourgeonnement à partir du Golgi CopII : 4 sous-unités protéiques –Bourgeonnement à partir du RE (a – Clathrine)

40 40 Toutes les vésicules ne sont pas sphériques Membranes contenant des protéines fluorescentes Long tubules qui émanent de endosomes et réseau trans-golgien (TGN) Ces tubules peuvent servir de transporteurs (grand rapport surface / volume) "une vésicule peut être tubulaire !"

41 41 c – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTPases monomériques, rappel

42 42 c – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTP binding proteins (rappel) GTP binding proteins –2 états Actif avec liaison de GTP Inactif avec liaison de GDP –2 types Monomérique (= GTPases monomériques) les mieux connues Trimérique (= GTPases trimériques = protéines G) Passage d'un état à l'autre par –GEFs (Guanine-nucleotide-Exchange Factors) GDP GTP –GAPs (GTPase-Activating Proteins) GTP GDP

43 43 Fig Formation d'une vésicule à COPII (RE) Sar 1-GTP recrute COPII vers la membrane = Sec12 GTPase monomérique recruteuse de manteau

44 44 GTP binding proteins (Rappel) Monomérique –GTPases GTPases de recrutement du manteau –Protéines ARF (ADP Ribosylation Factor) »Assemblage COPI et clathrine au Golgi –Protéine Sar 1 »Assemblage COPII au réticulum endoplasmique –? »Assemblage clathrine à la membrane plasmique Rab : amarrage des protéines de transport Etc… –Etc… Trimériques –Protéines G

45 45 Formation of secretory vesicles in the biosynthetic pathway Review Sylvie Urbé, Sharon A. Tooze and Francis A. Barr Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research Volume 1358, Issue 1, 21 August 1997, Pages 6-22 Protéines de formation des vésicules recouvertes de COP I- et COP II

46 46 GTPases de recrutement du manteau : les acteurs Membrane du RE Sar 1 GDP (= GTPases de recrutement du manteau) forte concentration, cytosolique, inactive GEF (Guanine-nucleotide-Exchange Factor)

47 47 GTPases de recrutement du manteau : la séquence Une vésicule à COPII est sur le point de bourgeonner (du RE) Une GEF spécifique (protéine de membrane du RE appelée Sec 12) se lie à la Sar 1 du cytosol et remplace le GDP de la Sar 1 par du GTP La Sar 1 GTP libère une queue d'acide gras lui permettant de se fixer dans la membrane du RE puis recrute des sous-unités de COPII La membrane bourgeonne en incluant des protéines membranaires sélectionnées

48 48 Fig Formation d'une vésicule à COPII

49 49 Désassemblage du manteau GTPases de recrutement du manteau Hydrolyse du GTP en GDP La queue est exclue de la membrane désassemblage du manteau C'est le temps qui finit par déclencher l'hydrolyse

50 50 Éléments d'approche 1.Les types de vésicules 2.Assemblage du manteau (les GTPases) 3.Guidage du transport (les SNARE) 4.Amarrage (protéines Rab) 5.Fusion

51 Guidage du transport Reconnaissance vésicule de transport membrane cible Toutes les vésicules de transport ont des marqueurs de surface spécifiques de leur origine et de leur cargo Les membranes cible ont des récepteurs complémentaires

52 52 Reconnaissance vésicule de transport membrane cible 1.SNAREs –Spécificité –Catalyseur de la fusion 2.Rabs (GTPases cible) –Amarrage initial –Fixation de la vésicule –En collaboration avec d'autres protéines

53 53 rab GTP-Binding Proteins A large family of MONOMERIC GTP- BINDING PROTEINS that play a key role in cellular secretory and endocytic pathways

54 54 Abréviations SNAREs : SNAP receptors SNAPs : soluble NSF attachment proteins NSF : N-ethylmaleimide-sensitive- fusion protein

55 55 Fig Rôle des SNAREs dans le guidage des vésicules de transport

56 56 SNAREs Au moins 20 espèces différentes Protéines trans-membranaires Marchent par deux : –v- SNAREs (vesicle) –t- SNAREs (target = cible) Domaine hélicoïdal qui s'enroule l'un dans l'autre complexe trans–SNARE qui contribue à la fusion des membranes

57 57 Complexe trans–SNARE Toujours 4 hélices –3 formées par t-SNARE –1 formée par v-SNARE Ici 3 protéines –v-SNARE 1 hélice (synaptobrévine) –t-SNARE 1 hélice (syntaxine) –t-SNARE 2 hélices (Snap25 : protéine périphérique)

58 58 Fig Structure de SNAREs appariés dans les terminaisons nerveuses

59 59 SNAREs nerveuses Cibles de neurotoxines –Tétanos –Botulisme Protéases qui entrent dans des neurones spécifiques, clivent les SNAREs et bloquent la transmission synaptique

60 60 Désassemblage du complexe trans-SNARE Après fusion le complexe SNARE est stable dans la membrane Doit être désassemblé NSF (N- ethylmaleimide- sensitive-fusion protein)

61 61 NSF Cycle entre les membranes et le cytosol Catalyse le désassemblage ATPase Ressemble à une chaperone cytosolique qui solubilise et aide à replier correctement les protéines dénaturées Déroule les hélices des SNAREs en collaboration avec des protéines adaptatrices

62 62 Fig Dissociation d'une paire v-SNARE t-SNARE par NSF une fois le cycle de fusion terminé –NSF + des protéines adaptatrices hydolyse ATP +séparation des SNAREs –La dissociation régule quand et où les membranes vont fusionner

63 63 Éléments d'approche 1.Les types de vésicules 2.Assemblage du manteau (les GTPases) 3.Guidage du transport (les SNARE) 4.Amarrage (protéines Rab) 5.Fusion

64 64 4 – Amarrage Rôle important des protéines Rab dans la spécificité du transport vésiculaire

65 65 Protéines Rab GTPases monomériques Plus de 30 membres la plus grande sous- famille de GTPases monomériques Distribution caractéristique sur les membranes cellulaires Chaque organite a au moins une protéine Rab sur sa face cytosolique Facilitent et régulent –Le taux d'amarrage des vésicules –et l'appariement des v- t- SNAREs

66 66 Table 13-1 Localisation sub-cellulaire de quelques protéines Rab

67 67 Localisation sub-cellulaire de quelques protéines Rab Rab1RE et Golgi Rab2cis Golgi network Rab3A vésicules synaptiques, granules sécrétoires Rab4endosomes pécoces Rab5A membrane plasmique, vésicules à manteau de clathrine Rab5Cearly endosomes tardifs Rab6citernes médianes et du trans Golgi Rab7endosomes tardifs Rab8vésicules sécrétoires (basolateral) Rab9endosomes tardifs, trans Golgi network

68 68 Protéines Rab Comme les GTPases de recrutement du manteau elles cyclent entre la membrane et le cytosol Comme les GTPases de recrutement du manteau, 2 états : –Inactif avec liaison de GDP dans le cytosol –Actif avec liaison de GTP associé à une membrane

69 69 [c – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTP binding proteins (rappel) GTP binding proteins : 2 états –Actif avec liaison de GTP –Inactif avec liaison de GDP Passage d'un état à l'autre par –(GEFs): GDPGTP (monomérique = GTPase ) –GTPase-Activating Proteins (GAPs) : GTPGDP (trimérique = protéines G) Guanine-nucleotide-Exchange Factors]

70 70 Fig Rôle des protéines Rab dans l'amarrage des protéines de transport Sar1 COPII formation de la vésicule Rab SNARE amarrage de la vésicule

71 71 Les effecteurs de Rab (1/2) Reconnaissance de Rab (Lié, GTP) par un Rab effecteur Gros complexe protéique Très variable d'une protéine Rab à une autre

72 72 Les effecteurs de Rab (2/2) Parfois longues protéines filamenteuses qui limitent le mouvement des vésicules entre des citernes golgiennes adjacentes Se lient à Rab et empêchent l'hydrolyse prématurée du GTP D'autres sont des moteurs qui dirigent les vésicules vers leur destination

73 73 Protéines Rab Agissent sur les protéines de contrôle des SNAREs Accélèrent le processus de reconnaissance des SNAREs entre elles Achèvent le verrouillage de la vésicule à sa cible par appariement des SNAREs prêt pour la fusion Après la fusion, la protéine Rab hydrolyse son GTP lié et retourne dans le cytosol

74 74 Éléments d'approche 1.Les types de vésicules 2.Assemblage du manteau (les GTPases) 3.Guidage du transport (les SNARE) 4.Amarrage (protéines Rab) 5.Fusion

75 75 5 – Fusion Distinguer amarrage de fusion Fusion ne fait pas toujours suite à amarrage : –eg : exocytose régulée Amarrage : les protéines des membranes interagissent et adhèrent Fusion : les couches lipidiques peuvent se joindre nécessité d'extrusion d'eau protéines de fusion pour résoudre le problème énergétique ( dynamine au cours du bourgeonnement des vésicules à clathrine)

76 76 Fig Modèle de concentration des protéines SNAREs au cours de la fusion de membrane –Des liposomes (in vitro) v-SNAREs + des liposomes t-SNAREs fusion lente –Intervention (dans la cellule) d'autres protéines pour initier la fusion ou pour retirer des protéines inhibitrices

77 77 Importance des phénomènes de fusion de membrane Transport vésiculaire Fécondation (fusion oolemme spermatozoïde) Fusion des myoblastes Maintien de l'identité des cellules Maintien de l'identité des compartiments intra-cellulaires Mode d'entrée des virus à enveloppe dans les cellules

78 78 Analogie protéines de fusion virales SNAREs Human Immunodeficiency Virus (HIV) –Se lie aux récepteurs de la surface de la cellule –Les membranes de la cellule et du virus fusionnent –L'acide nucléique viral entre dans la cellule et s'y réplique Virus influenza –Entrée du virus dans la cellule par endocytose –Arrivée dans l'endosome –Activation d'une protéine de fusion de l'enveloppe virale –Fusion de la membrane virale et de la membrane endosomale –L'acide nucléique viral entre dans le cytosol et s'y réplique

79 79 Fig Entrée d'un virus à enveloppe dans la cellule

80 80 Entrée d'un virus à enveloppe dans la cellule Liaison de HIV à la protéine CD4 à la surface des lymphocytes… …par lintermédiaire de la protéine virale gp120 liée à la protéine de fusion de HIV Une 2ème protéine de surface de la cellule hôte qui sert normalement de récepteur aux chimiokines agit avec gp120 Séparation de gp120 et de la protéine de fusion Enfouissement de la partie hydrophobe de la protéine de fusion dans la membrane La protéine de fusion (trimère) se comporte transitoirement comme une protéine de membrane dans deux membrane opposées Réarrangement spontané de la protéine de fusion qui se collabe en une structure compacte de 6 hélices Libération dénergie rapprochement des membranes

81 81 Résumé Les manteaux GTPases (Sar1 et ARF) GTPases (Rab) SNAREs

82 82

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