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CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE OU CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM) CHAPITRE V.

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1 CHROMATOGRAPHIE PLANAIRE OU CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM) CHAPITRE V

2 Est une technique complémentaire de la CLHP ; Mise en oeuvre de ces deux techniques soit, la séparation et la nature de phases restent les mêmes ; Analyse quantitative (reproductibilité des dépôts et la nature des concentrations), (densimètres automatiques) Mise en oeuvre de la chromatographie planaire. On utilise des plaques (verre, plastique, ou Aluminium, recouverte dune fine couche (100 – 200 µm) de phase stationnaire (gel de silice modifié ou non) ; Les mélanges à séparer est déposer sur la couche adsorbante. Le chromatogramme est développé dans une cuve contenant le solvant délution ; I – INTRODUCTION

3 Le choix des solvants délution est guidé par les caractéristiques des substances à séparer. On considère que les substances sont hydrophiles (soluble dans leau) ou hydrophobes (insoluble dans leau), puis on contrôle leurs propriétés acides, basiques, ou neutres et enfin la possibilité de réactions chimiques avec le solvant délution aussi bien quavec ladsorbant. Sur la base de ces considérations, on a développé deux types de phase stationnaire : Pour les substances hydrophobes : oxyde daluminium, gel de silice, cellulose acétylée, polyamide. Pour les substances hydrophiles : celluloses, kieselgular (terre de diatomée), polyamide.

4 Les avantages propres à la chromatographie planaire : Temps de développement courts (2 à 60 min) Distances de séparation petites ; Très bonne résolution ; Très haute sensibilité ; Très petites quantités déchantillon utilisées. Chaque composé est défini par R f (abréviation " retardation factor") qui correspond à sa migration relative par rapport au solvant : Distance parcourue par le soluté X R f = = Distance parcourue par le front de solvant X 0

5 On définit lefficacité N de la plaque pour un composé dont la distance de migration est X et le diamètre de spot w par la relation. N = 16 et H = w 2 N X 2 X Pour calculer le facteur de rétention K dun composé où la sélectivité entre deux composés. On pourra relier R f et K : R f = = = = X 0 ù 0 t K + 1 X ù t K = - 1 R f

6 On admettra que la résolution a pour valeur R = 2 W 1 + W 2 X 2 – X 1 Révélation post – Chromatographique Pour les composés incolores, ils doivent être révélés ; Pour faciliter la localisation des taches, il existe des plaques contenant (sel de Zine) fluorescent ajouté à la phase stationnaire ; En éclaire la plaque avec une lampe à vapeur de mercure (lumière de Wood), on voit apparaître des taches sombres aux endroits où se trouvent les composés qui absorbent la radiation excitatrice ; Une méthode quasi universelle, la plaque est soumise à un " pluverisation" dacides sulfuriques, ensuite en carbonise les composés en chauffant la plaque.

7 Paramètres de séparation et de rétention Plaque de CCM Vapeur de léluant Eluant X1X1 X0X0 CCM quantitative : Pour rendre la CCM quantitative, il faut pouvoir quantifier les taches. Dans ce but, la plaque à examiner est déplacée sous loptique dun densitomètre (ou scanner) qui mesure soit labsorption, soit la fluorescence à une ou plusieurs longueurs dondes. Cet appareil conduit à un pseudo chromatogramme comportant des pics dont on mesure les aires.

8 Front absorbance 60 - Start unités arbitraires

9 La chromatographie d exclusion ou de perméation de gel est fondée sur les rétentions sélectives des molécules de soluté en fonction de leur taille en raison de leur pénétration dans les pores, remplies de solvants, d une phase stationnaire appropriée. Les grosses molécules exclues de la totalité ou d une partie seulement des pores de la phase stationnaire, migrent plus rapidement que les petites molécules qui peuvent pénétrer dans un plus grand nombre de pores. La séparation est donc basée sur la totalité des molécules en solution CHROMATOGRAPHIE DEXCLUSION

10 Le détecteur utilisé dans cette technique est presque exclusivement le réfractomètre différentiel. Le volume de rétention VR des molécules x est donné par léquation : VR = Vi + kVp Vi : volume interstitiel de la colonne ; Vp : volume des pores de la phase stationnaire ; K : coefficient de distribution des molécules x.

11 Il y a deux cas limites : K = 0 : les molécules considérées sont totalement exclues, en raison de leur taille, des pores de la phase stationnaire et lon a : V R = V i Toutes les molécules sortent en même temps de la colonne après le passage dun volume de solvant égal au volume interstitiel de la colonne. K = 1 : Tous les pores de la phase fixe sont accessibles aux molécules considérées et lon a : V R = V i + kV p = V T VT est appelé volume de perméation totale.

12 En chromatographie dexclusion, on a lhabitude de porter le logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume de rétention. La courbe obtenue présente généralement une partie linéaire. A chaque valeur du volume de rétention correspond une masse moléculaire. ViVi V p V R VTVT K = 0 Exclusion Perméation sélective Perméation totale K =


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