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La détection des mutations: pourquoi? fins diagnostics: - validation du diagnostic chez individu symptomatique - Pathologie héréditaire (maladie génétique)

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1 La détection des mutations: pourquoi? fins diagnostics: - validation du diagnostic chez individu symptomatique - Pathologie héréditaire (maladie génétique) ou somatique (cancer) Déterminer si un gène candidat est responsable de la pathologie Etudier les relations structure/fonction du gène NB: Diagnostic génotypique pas forcément nécessaire: - En France, dépistage néonatal systématique de 3 maladies génétiques (phénylcétonurie, mucoviscidose, et drépanocytose) par des approches biochimiques

2 L A DÉTECTION DES MUTATIONS : COMMENT ? Deux situations différentes: Mutations connues: criblages (screening) Mutations inconnues:Balayage (scanning) Un seul gène ou plusieurs gènes -Mutation unique (très rare) -Mutations prédominantes par effet fondateur -Points chauds de mutations -Spectre bien défini avec fréquences allèliques dans la population Un gène ou plusieurs gènes candidats recherche sur la totalité du gène

3 MaladieGèneMutationRemarque DrépanocytoseHBBUn seul codon (6), un seul faux-sens (Glu->Val), une seule mutation (GAG ->GTG) Monoallélisme stricte Achondroplasie FGFR3 Un seul codon (380), un seul faux-sens (Gly->Arg), deux mutations nt1138 (G->A; G->C) Monoallélisme par récurrence en un point chaud MucoviscidoseCFTRDel508 >1300 autres 66% des allèles 30% des allèles Myopathie de DuchenneDMDDélétion de 1 ou plusieurs exons Duplication de 1 ou plusieurs exons Mutation ponctuelle variable 65% des allèles 10% des allèles 25% des allèles Neurofibromatose de type 1 NF1>250 mutations différentes (74% petites mutations) Taux de néomutations élevé (10- 4 )

4 L A DÉTECTION DES MUTATIONS : COMMENT ? ( SUITE ) L ES AUTRES FACTEURS INFLUENÇANT LA STRATÉGIE : - La nature attendue des mutations - La taille et la structure du locus exploré - Le matériel disponible (ADN, ARNm) - Le degré de sensibilité nécessaire

5 L A DÉTECTION DES MACROMUTATIONS - 1) Cytogénétique classique et cytogénétique moléculaire -2) Southern blot -3) PCR fluorescente -4) RT-PCR ADN ARN Grandes délétions, insertions, duplications, inversions et translocations plusieurs centaines de pb voir des milliers

6 1) C YTOGÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Principe: lADN est visualisé grâce à une sonde qui est soit un haptène ( ex: digoxigénine) révélé par un anticorps fluorescent ou directement par un fluorochrome Cibles: uniques de lordre de quelques Kb mais aussi des cosmides, YAC. Applications du FISH: - cartographie des marqueurs (Bac ou Yac) sur des chromosomes métaphasiques (lune des phases de la mitose) et en particulier les bac chimères - identification des chromosomes en particulier dans les hybrides somatiques surtout après irradiation qui fragmente les chromosomes - identification de petits fragments chromosomiques remaniés - hybridation in situ en interphase permettant didentifier sur de la chromatine des séquences distantes de 100kB seulement ainsi que des chromosomes remaniés

7 FISH ciblée FISH locus spécifique Sonde spécifique de gènes ou loci Peinture chromosomique Sonde de peinture dun chromosome entier Ex: Détection t(9;22) dans les LMC Ex: t(8;21) dans une LMA

8 Méthodes de FISH global CGH Comparative Genome Hybridization) M-FISH (multi-FISH) SKY (Spectral karyotyping) 24 sondes de peinture chromosomiques spécifique des 22 autosomes et X/Y. Utilisation dun mélange de sondes dont la composition est spécifique dun chromosome donné. -ADN génomique testé et ADN génomique témoin Méthode permettant de quantifier et de localiser des microremaniements dADN - La résolution est maximale car elle ne dépend que de lobjet à analyser - Très utilisée pour les remaniements dans les cancers - Shéma expérimental (diapo suivante) Ex: translocation (7p;12q) (Dupont JM, Cochin)

9 L A MÉTHODE DE CGH CGH sur chromosomes CGH sur microarray Résolution 5-10Mb Résolution dépend du matériel génomique utilisé. Permet de descendre à léchelle de lexon Numérisation du signal -> lecture quantitative

10 2) L E S OUTHERN BLOT -Permet de visualiser une portion du génome par hybridation dune sonde marquée sur des fragments de restriction dADN séparés par électrophorèse. -Limite supérieure de résolution: 20 kb. -Pour lanalyse de plus grand fragment dADN génomique, electrophorèse en champs pulsés résolution max 1Mb) Modifications de la carte de restriction si macromodification Inconvénients: Difficultés de détection des anomalies quantitatives hétérozygotes: saturation du signal lors de la détection

11 3. Les dérivées de la PCR =Amplification au cours dune même PCR de plusieurs régions différentes -taille de chaque amplicon différente -oligonucléotides de Tm proches Analyse de lADN La PCR multiplex Mise au point assez complexe ATG TAA TAG TGAAATAAA Amplicon 1 Amplicon 2Amplicon 3Amplicon 4

12 3) L A PCR FLUORESCENTE -Amorce ou dNTP marqués par un fluorochome et analyse du produit damplification sur un séquenceur -Optimisation 1: PCR multiplex (amplification de plusieurs régions différentes) -Optimisation 2: PCR semi-quantitative (faible nombre de cycles et analyse quantitative de la fluorescence) Pertes ou gains damplicons entiers visualisés par absence de lamplicon ou variation dintensité (si hétérozygotie)

13 4) La RT-PCR -Amplification des ARNm après étape de synthèse de cDNA simple brin Permet de détecter: - Perte ou gain de matériel visualisé par une anomalie de longueur de lamplicon -Transcrit ampliflié en un seul ADNc ou plusieurs fragments chevauchants - des ARNm chimères avec des amorces spécifiques

14 -Amplification des ARNm après étape de synthèse de cDNA simple brin -Transcrit amplifié en un seul cDNA ou plusieurs fragments chevauchants Permet de balayer la totalité de la séquence codante en un petit nombre de fragments chevauchants Analyse de lARN 1. La RT-PCR OMGP EVI2A ADNc NF1 250 bp Exons EVI2B27b a Exemple de lamplification de lADNc NF1 en 9 fragments chevauchants couvrant les 9000pb de séquence condante

15 Cas particulier: L ES AMPLIFICATIONS DE TRIPLETS - Catégorie de maladies dues à des amplifications de triplets CAG, GCG,CTG - dans un exon codant: CAG (maladie de Huntington) - dans la région 3UTR: CTG (maladie de Steinert) - dans la région promotice: CGG (Syndrome du x fragile) - dans un intron: FAA (maladie de Freidrich) -Analyse par Southern blot - Analyse génotypique par PCR -Problèmes méthodologiques si expansion trop importante

16 D ETECTION DES S UBSTITUTIONS Inconnues (Scanning ) -Clivage spécifique (chimique, enzymatique) -SSCP (Single strand Conformational Polymorphism) -DGGE (Denaturing gradient Gel Electrophoresis) -PTT (Protein Truncation Test): détection spécifique des codons STOP Connues (Screening) + séquençage -Southern ou PCR-hydrolyse pour mutations modifiant un site de restriction -Séquençage -PCR-ASO (Allele Specific Oligoprobe) -PCR-OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) -PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System) -PCR suivie dhybridation sur puces

17 M ÉTHODE SSCP Principe: La perturbation de séquence induit un changement de conformation du DNA simple brin -Sensiblité: 60-80% de mutations détectées Mise en évidence Conformation des brins électrophorèse en gel dacrylamide non dénaturant

18 Méthode DGGE (Denaturated Gradient Gel Electrophoresis) - La perturbation de séquence induit un modification de la température de fusion -Bonne sensiblité -Mis en évidence par electrophorèse en gel dacrylamide en gradient dénaturant -Choix des amplicons doit tenir compte des domaines de fusion de la séquence -Amplicons de pb

19 L E P ROTEIN T RUNCATION T EST (PTT) -Mise en évidence dune protéine tronquée due à la présence dun codon STOP prématuré -Promoteur T7 ajouté à lamorce 5 Système de transcription/traduction in vitro Analyse des polypeptides sur SDS-PAGE

20 Méthode de PCR-ASO - Mésappariements dans un court fragment diminuent la température de fusion de l hybride - Synthèse de 2 oligosondes: Séquence normale Séquence mutée - Hybridation avec produit PCR de la région à étudier: conditions ne permettant que les appariements parfaits - Visualisation par dot-blot Nécessité détudier des témoins en parallèle

21 Techniques basées sur une extension différentielle damorce MALDI-TOF: Miniséquençage: Allèle normalAllèle muté T A C G Extension damorce (Taq Pol) + F1-ddTTP +F2-ddCTP T A C G Elimination des ddNTP et analyse du produit dextension + ddNTP Miniséquençage: analyse de fluorescence sur séquenceur dADN MALDI-TOF: analyse de masse moléculaire de loligo


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