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Les réactions antigènes-anticorps Cécile Balter Paul Rouzaire Année 2009-2010.

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1 Les réactions antigènes-anticorps Cécile Balter Paul Rouzaire Année

2 2 I.PRESENTATION 1. A quoi cela va-t-il vous servir ? 2. Quels sont les champs dapplication ? 3. Interactions Ag-Ac 4. Quelles techniques utiliser ? II. IMMUNODOSAGES SANS MARQUEUR 1. Agglutination 2. Précipitation 3. Neutralisation 4. Immunochromatographie III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radio immunologie IV. CONCLUSION Les réactions antigènes - anticorps :

3 3 I. PRESENTATION : 1. A quoi cela va-t-il vous servir ? 2. Quels sont les champs dapplication ? 3. Interactions Ag-Ac 4. Quelles techniques utiliser ?

4 4 I. 1. A quoi cela va-t-il vous servir ? Utilisations pratiques : à faire un diagnostic à interpréter le résultat de ce diagnostic à commenter un bilan biologique Utilisations plus fondamentales : préparation de réactifs à usage in vitro ou in vivo compréhension de mécanismes fondamentaux compréhension de pathologies

5 5 I. 2. Quels sont les champs dapplication ? Identification et/ou dosage dun Ag : Identification dune cellule Identification dun agent infectieux Identification et/ou dosage dune protéine Dosage dune hormone Dosage dun médicament … Mise en évidence et/ou titrage dun Ac : Diagnostic et suivi sérologique dune infection Sérologies bactériennes : Fièvretyphoïde, syphilis … Sérologies virales : Hépatites, grippe, rubéole, HIV … Sérologies parasitaires : Toxoplasmose … Contrôle de vaccination Diagnostic et suivi sérologique dune maladie auto immune Diagnostic sérologique dune allergie Suivi dune grossesse Suivi dune transplantation …

6 6 I. 3. Interactions Ag/Ac (1/8) : Entre : Lépitope de lAg (ou déterminant antigénique) et le paratope de lAc (ou régions de complémentarité : CDR) Interaction réversible : Pas de modifications irréversibles de lAg ou lAc Implique plusieurs interactions, non covalentes : - Liaisons faibles par rapport à une liaison covalente : un grand nombre nécessaire - Liaisons qui opèrent sur une très courte distance : grande complémentarité : excellente spécificité

7 7 I. 3. Interactions Ag/Ac (2/8) : Affinité : Force des interactions entre un seul site de fixation de lAg sur un Ac et un seul épitope. Avidité : Résultante des interactions entre les déterminants multiples et répétés dun antigène et les sites de liaisons multiples dun anticorps. - Meilleure mesure de la capacité de liaison au sein des systèmes biologiques - Une forte avidité peut compenser une faible affinité (ex : IgM pentamériques vs IgG) Ac polyclonaux vs Ac monoclonaux

8 8 I. 3. Interactions Ag/Ac (3/8) : Réaction réversible : loi daction de masse à léquilibre : ka [Ag] + [Ac] [Ag - Ac] kd A léquilibre, selon la loi daction de masse : [Ag]. [Ac] x ka = [Ag - Ac] x kd [Ag - Ac]ka = = Ka [Ag] [Ag]kd Ka = constante daffinité (ou dassociation)

9 9 LA REPRESENTATION DE SCATCHARD : [ Ag - Ac] Ka = [Ag ].[Ac] Si : F = [Ag] et B = [Ag - Ac] B Ka = F. [Ac] Si : [Ac] T = concentration totale en anticorps B Ka = F. ([Ac] T - B) B = Ka ([Ac] T - B) F B = - Ka.B + Ka.[Ac] T F I. 3. Interactions Ag/Ac (4/8) :

10 10 I. 3. Interactions Ag/Ac (5/8) : LA REPRESENTATION DE SCATCHARD : B/F B[Ac] T Ka. [Ac] T Pente = -Ka

11 11 Conditions physiochimiques : pH : liaison quand pH Force ionique : liaison quand force ionique Température : en général de laffinité avec température (37°C) Réactivité croisée : Si deux Ag différents partagent un épitope identique Si des Ac spécifiques dun épitope se fixent à un épitope non apparenté possédant des propriétés physicochimiques semblables Rq : souvent observée pour des Ag polysaccharidiques qui contiennent des résidus oligosaccahridiques semblables (Ex :Ag des groupes sanguins ABO) I. 3. Interactions Ag/Ac (6/8) :

12 12 I. 3. Interactions Ag/Ac (7/8) : Zone déquivalence / Phénomène de zone Sensibilité / Spécificité - Pour une réaction - Pour linterprétation dun résultat Courbes ROC Reproductibilité (CV) / Précision

13 13 I. 3. Interactions Ag/Ac (8/8) : Détection et/ou dosage dAg : Ag étalons Ac de référence Résultats quantitatifs ou qualitatifs Détection et/ou titrage dAc : Pas de sérum étalon Ag de référence Dépistage : résultat qualitatif Titre : résultat semi quantitatif Sérums de calibration Seuil de positivité Différence IgM / IgG Ac dinfection / Ac protecteur

14 14 I. 4. Quelles techniques utiliser ? Techniques possibles : Méthodes nutilisant pas de marqueur : observation directe - Immunoprécipitation - Agglutination - Neutralisation - Immunochromatographie Méthodes utilisant un marqueur : observation indirecte - Radioimmunologie - Immunoenzymologie - Immunofluorescence

15 15 II. IMMUNODOSAGES SANS MARQUEUR : 1. Agglutination 2. Précipitation 3. Neutralisation 4. Immunochromatographie

16 16 II. 1. Réactions dAGGLUTINATION (1) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Applications Ag : présent à la surface dune particule Ac : agglutinines, IgM, liaison multivalente Réseau tridimensionnel Sensibilité : de 0,001 à 0,3 mg/L Lecture : à lœil Détections / dosages dAg Détections / titrages dAc

17 17 II. 1. Réactions dAGGLUTINATION (2) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Applications Agglutination directe : Ag directement particulaire (bactéries, hématies …) Agglutination passive, indirecte, conditionnée : Un Ag ou un Ac soluble qui est fixé artificiellement sur une particule inerte (latex …) Test négatif Test positif Ac Ag

18 18 II. 1. Réactions dAGGLUTINATION (3) :

19 19 _ + II. 1. Réactions dAGGLUTINATION (4) :

20 20 II. 1. Réactions dAGGLUTINATION (5) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Applications Exemples : Groupes sanguins Test de Coombs direct et indirect Sérotypage des bactéries Sérodiagnostic des fièvres typhoïde et paratyphoïde, de la brucellose Sérodiagnostic de la Syphilis : THPA / VDRL …

21 21 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (1) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications Ag : Soluble Ac : Précipitines, Ig polyclonales Réseau tridimensionnel Lecture : - Néphélémètre - Turbidimètre - Oeil Sensibilité : de 3 à 0,01 mg/L

22 22 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (2) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications Précipitation en milieu liquide : - Néphélémétrie - Turbidimétrie Précipitation en milieu gélifié : - Immunodiffusion radiale : Mancini - Immunodiffusion double : Ouchterlony Techniques didentification : - Immunoélectrophorèse - Immunofixation

23 23 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (3) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications Immunodiffusion radiale : Technique de Mancini : Plaque de gélose contenant un Ac dans le gel en concentration connue Dépôt de lAg à doser dans un puits Diffusion sur plusieurs jours (2-10) Surface du disque généré proportionnelle à la quantité dAg Technique simple, mais technique manuelle Dosage assez précis (CV < 10%) Faibles volumes de spécimens ( qq.mL ) Interférences : hémolyse, lactescence Peu adaptée aux grosses molécules (IgM)

24 24 Immunodiffusion double : Technique dOuchterlony : Disque de gélose Diffusion sur plusieurs jours (~2) Méthode qualitative et comparative Interprétation parfois difficile Quantification approximative II. 2. Réactions de PRECIPITATION (4) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications

25 25 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (5) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications Technique de Mancini :Technique dOuchterlony :

26 26 Technique de Mancini :

27 27 Technique dOuchterlony :

28 28 Technique dOuchterlony :

29 29 Electrophorèse en fusée (EID, Technique de Laurell) –Ac mélangé avec gélose à pH 8,6 –Migration de lAg (~3-4h) –Hauteur de larc = [Ag] –Réfrigérer plaques de migration Electrosynérèse –Dépôt des Ac et Ag en puits –Migration à pH 8,0 –Migration Ag par électrophorèse –Migration Ac par électroendosmose –Sensibilité > IDR –Nombreux faux positifs II. 2. Réactions de PRECIPITATION (6) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications

30 30 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (7) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications Zone dexcès dAcZone dexcès dAg Zone déquivalence Anticorps ajouté Ac Précipité Piège majeur : EXCES dANTIGENE Immunserums : Cheval : complexes immuns maintenus + longtemps en solution Lapin : limite de détection + basse

31 31 Excès dantigène : Solubilisation des complexes Ag-Ac par les Ag libres Même valeur du signal 2 valeurs différentes de la concentration en analyte (risque = rendre une valeur normale ou très sous-estimée). Solutions : - 2nde addition dAg : pas de rebond du signal - Mesure Vmax et tmax - Aspect des pics dimmunoprécipitation en flux continu II. 2. Réactions de PRECIPITATION (8) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications

32 32 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (9) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications Immunonéphélémétrie : Déviation de la lumière par des complexes immuns en milieu liquide (Cf chimie analytique) Si échantillons dilués : minimisation de la réflexion et lauto- absorption, mais sources de forte intensité et photodétecteurs sensibles Problèmes : - Excès dAg - Diffusion « non immunologique » de la lumière par particules en suspension ou des substances lipidiques - Nécessité danalyseurs spécialisés

33 33 Immunonéphélémétrie : Échantillon Source lumineuse Lumière non déviée Lumière déviée Cellule photoélectrique + -

34 34 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (10) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications Immunoturbidimétrie : Absorption de la lumière par des complexes immuns en milieu liquide (Cf chimie analytique) Nécessité dune grande sensibilité des spectrophotomètres Sur des analyseurs de biochimie Problèmes : - Excès dAg - Interférences ictère, hémolyse et hyperlipémie

35 35 IDREID NéphélométrieTurbidimétrie Rapidité 48h3-4hQuelques minutes Exécution ManuelAutomatisé Interprétation DélicatePlus Facile Valeur chiffrée directe mais interférences possibles Sensibilité ~ 1 mg/L EID < IDR Fonction du bruit de fond 1 µg/L (latex) Précision 8-10%5%< 5% II. 2. Réactions de PRECIPITATION (10) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications

36 36 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (11) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications Immunoélectrophorèse (IEP, Grabar et Williams) Séparation des protéines par électrophorèse dans un gel d'agarose Puis double diffusion contre des Ac spécifiques (~48h) Méthode qualitative +++ et comparative Faible coût Quantification approximative Personnel formé et expérimenté Phénomène de zone si excès dAg Cercle de précipitation avec cryoglobulines ou IgM polymérisées Technique de référence pour m.e.e Ig monoclonale

37 37 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (11) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications

38 38 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (12) : Immunofixation : Séparation des protéines par électrophorèse dans un gel d'agarose (sur plusieurs pistes) Dépôt dantisérums monospécifiques, individuellement sur chaque piste de migration Coloration des complexes immuns précipités Dilution du sérum en fonction de la concentration en Ig totalespour limiter effet de zone Interférences analytiques : fibrinogène, lipides / hémolyse Problèmes si cryoglobuline ou IgM polymérisée Rapidité (<2h) et Facilité de lecture (plusieurs Ig MC) Sensibilité > à lIEP (mais attention aux erreurs par excès) a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications

39 39 Immunofixation : IgM Kappa

40 40 Immunofixation : IgG et IgA Lambda

41 41 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (13) : Immunosoustraction : Mise en contact protéines et Ac spécifiques fixés sur billes de sépharose Électrophorèse capillaire de zone (gel de PAA) sur les surnageant Moins sensible que lIF (pic étroit individualisable) => risque de faux négatifs Automatisée SPEAnti-IgGAnti-Kappa a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications

42 42 IEPIFIS Rapidité ~ 48h< 4h~ 30min Exécution Personnel expérimenté Simple Automatisable Automatisé Interprétation SubjectiveAssez facileFacile Sensibilité Qualitatif Oui Semi - quantitatif OuiNon± Coût ++++ II. 2. Réactions de PRECIPITATION (13) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications

43 43 II. 2. Réactions de PRECIPITATION (14) : a. Caractéristiques b. Méthodologies c. Précipitation en milieu gélifié d. Précipitation en milieu liquide e. Précipitation : méthodes didentification f. Applications Dosage des protéines sériques : –IgG, IgM, IgA –Albumine –CRP –Haptoglobine … Identification de : –Ig monoclonale –… Recherche dAc : –FR –ASL

44 44 II. 3. Réactions de NEUTRALISATION (1) : Ag : - enzyme (SLO) - hémagglutinine virale / rubéole, grippe … Ac : - neutralisant - IgA ou autres - protecteur Sensibilité : - environ 1mg/L

45 45 II. 3. Réactions de NEUTRALISATION (2) : Application : Détection et titrage dAc anti Streptolysine O (ASLO) (Cf bactériologie) (http://stl_bjb.ac-dijon.fr/biohum/bhaslo.htm)http://stl_bjb.ac-dijon.fr/biohum/bhaslo.htm Lyse des hématies Lhémoglobine intra- érythrocytaire est rejetée dans le milieu Action de la SLO sur les hématies : Détection des ASLO par neutralisation : Sérum qui contient des ASLO Sérum qui ne contient pas dASLO + + NEUTRALISATION Pas de neutralisation + + Pas de lyse des hématies, les SLO sont neutralisées Lyse des hématies SLO Hématies +

46 46 II. 3. Réactions de NEUTRALISATION (2) : Puis dilutions successives du serum pour titrage des ASLO :

47 47 II. 4. Réactions dIMMUNOCHROMATOGRAPHIE (1) : Test de Détection Rapide Technique sandwich Recherche dAg : - Streptocoque du groupe A - Détection de toxines bactériennes - Recherche de Plasmodium - Recherche de médicaments - Détection dhormone - … Recherche dAc : - Syphilis - Maladie de Lyme - Maladie coeliaque - Ac anti tétanique - …

48 48 migration dépôt Contrôle migration Si Ac+ C C Ag conjugué à particules dor ou coloré Ac (sérum) ? C Ag fixé Ac fixé II. 4. Réactions dIMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) :

49 49 migration dépôt Contrôle migration Si Ac- C C Ag conjugué à particules dor ou coloré Ac (sérum) ? Ag fixé Ac fixé C II. 4. Réactions dIMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) :

50 50 migration dépôt Contrôle migration Si Ag+ C C Ac conjugué à particules dor Ag (sérum) ? C Ac fixé Ad fixé II. 4. Réactions dIMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) :

51 51 migration dépôt Contrôle migration Si Ag - C C Ac conjugué à particules dor Ag (sérum) ? C Ac fixé Ag fixé II. 4. Réactions dIMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) :

52 52 NégPos II. 4. Réactions dIMMUNOCHROMATOGRAPHIE (2) : Ininter- prétable

53 53 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

54 54 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Réaction Ag-Ac avec Ag ou Ac marqué par un traceur Différenciation traceur libre / traceur lié ([Ag-Ac]) - Signal mesuré après séparation (phase hétérogène) - Modification du signal (phase homogène) Nombreuses techniques en fonction - de la nature du traceur (isotopique, enzymatique, luminescent, fluorescent) - du procédé : indirect, compétitif ou sandwich

55 55 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Procédé sandwich : (IRMA, IEMA, IFMA, ICMA) - En excès dAc - Réaction totale - Signal croissant avec la concentration dAg à doser Avantages : - Sensibilité, précision, spécificité et domaine de mesure Praticabilité accrue Mais : - Seulement pour les Ag de MM élevée (2 sites antigéniques) - Effet crochet pour les concentrations élevées - Superspécificité, Ac hétérophiles (anti-Ig animales du réactif) Lavage EEEE SS Puits avec lAc adsorbé Ajout de lAg à doser Ajout de lAc secondaire conjugué à un enzyme Ajout du substrat de lenzyme et mesure de lintensité de coloration [Ag] Signal fraction liée

56 56 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Effet crochet : Chute paradoxale du signal mesuré en présence d'une forte concentration de l'Ag à doser et obtention d'une courbe en cloche. Même valeur du signal 2 valeurs différentes de la concentration en analyte (risque = rendre une valeur normale ou très sous-estimée). Solution : diluer EE EE

57 57 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Procédé compétitif : (RIA, EIA, FIA, CLIA) - En défaut dAc - Réaction à léquilibre - Signal décroissant avec la concentration dAg à doser Avantages : - Pour tous les Ag (même les haptènes) - Phase homogène possible (FPIA, EMIT) Mais : - Domaine de mesure restreint - Mauvaise précision, spécificité moindre, moins praticable Lavage E S Incubation de l Ac avec lAg à doser Placer le mélange Ag-Ac dans un puits avec lAg adsorbé Ajout de lAc secondaire conjugué à un enzyme Ajout du substrat de lenzyme et mesure de lintensité de coloration [Ag] Signal fraction liée E

58 58 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie Procédé indirect : (IF, ELISA) - Signal croissant avec la concentration dAc à doser Avantages : - Etude des classes et sous classes des Ac Mais : - Problème dexpression des résultats Lavage EE EE SS Puits avec lAg adsorbé Ajout de lAs spécifique à doser Ajout de lAc secondaire conjugué à un enzyme Ajout du substrat de lenzyme et mesure de lintensité de coloration [Ac] Signal fraction liée

59 59 TraceurAvantagesInconvénients Radioactif 3 H, 125 I, 57 Co- Faible encombrement stérique - Signal démission direct, spontané et spécifique - Précision, LD basses - Législation - Gestion des risques, déchets, commandes - Peut être automatisée Enzymatique HRP, PAL, G6PD - Pas dappareillage spécialisé - Simplicité du marquage - LD moins bonnes - Très dépendant des conditions opératoires - Faible dynamique du signal - Automatisable III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

60 60 TraceurAvantagesInconvénients Fluorescent Fluorescéine 4MUP £ Chélates de lanthanides (Eu) - Facilité de marquage - Stabilité du traceur - Précision, LD basses - Quenching - Conventionnels : *LD peu favorables *Interférences *Faible dynamique du signal Luminescent Luminol Esters acridium Dioxétanes Sels de Ru - Stabilité du traceur - Signal très spécifique - Acquisition rapide et grande dynamique du signal - Quenching - Signal fugace - Appareillage spécialisé Rq : 4MUP : 4 methyl umbelliferyl phosphate III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

61 61 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur lequel une enzyme a été fixée Marqueurs : - Phosphatase alcaline, peroxydase - Ag ou Ac marqué par une enzyme Révélation par un : - Substrat chromogène : spectrophotomètre - Substrat luminogène : chimiluminescence Phase hétérogène Sensibilité : environ 0,00001 mg/L Résultats qualitatifs, semi quantitatifs ou quantitatifs

62 62 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Méthodologies : ELISA indirect ELISA compétitif ELISA sandwich Chimioluminescence Techniques dérivées : - Western Blot - ELISPOT - Immuno peroxydase 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

63 63 ELISA par compétition Recherche dun Ac P P signal [Ac] à doser Ac marqués à la phosphatase alcaline Ac à doser P Lecture spectrophotométrique III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

64 64 ELISA indirect Recherche dun Ac E E E Ag fixé sur le support (cupule) Ac recherché Ac anti Ig totales ou de classe marqué par une enzyme Révélation substrat chromogène E III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

65 65 ELISA sandwich Recherche dun Ag E E Ac spécifiques de lAg recherché Ag recherché Ac spécifiques de lAg recherché Ac anti Ig marqués par une enzyme Révélation substrat chromogène E III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

66 66 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Technique dérivée : Immunotransfert = immuno-empreinte = Western Blot : Séparation par électrophorèse sur gel de PAA (+ résolutif) Transfert sur une membrane (de nitrocellulose, par exemple) Dépôt d'un Ac spécifique, suivi d'un second Ac marqué par une enzyme Pour lanalyse et lidentification des Ac Technique longue Sensibilité +++ (20 µg/mL) Faible coût, interprétation facile 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

67 67 Western Blot Ag fixés sur le support Ac recherchés Ac de chèvre anti IgG marqués à la phosphatase alcaline P PM P PPPPPPPPPPP III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

68 68 Western Blot HIV1 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

69 69 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Ac anti histones 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

70 70 Ac Anti ribosomes III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

71 71 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Technique dérivée : ELISPOT Dénombrement au sein dune suspension hétérogène des cellules sécrétant des Ac spécifiques ou des cytokines. Sensibilité +++ (10 -5 ) Elimination des cellules et Lavage E Puits avec lAc anti-cytokine adsorbé Ajout de lAc anti- cytokine conjugué à un enzyme S NS S Ajout de la population de cellules à tester S Ajout du substrat de lenzyme et dénombrement des spots Puits vu de dessus Spot = emplacement de la cellule sécrétrice 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

72 72 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Technique dérivée : ELISPOT 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

73 73 1 : Ag ? 2 : Ac spécifique 3 : Anti Ig 4 : Avidine-biotine-peroxydase Technique dérivée : Immunopéroxydase III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

74 74 Ag : –Recherche dAg bactériens, viraux fongiques, parasitaires –Dosages hormonaux –Dosages de médicaments –… Ac : –Auto immunité –Sérologies bactériennes –Sérologies virales –Sérologies parasitaires –IgE spécifiques –… III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Applications de lELISA : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

75 75 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie IF : IMMUNOFLUORESCENCE : Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur lequel un produit fluorescent a été fixé Marqueurs : - fluorescéine, rhodamine, phycoérythrine - Ag ou Ac marqué par un produit fluorescent Phase hétérogène Révélation au microscope à fluorescence Utilisation de banques dimages Sensibilité : environ 0,1 mg/L Résultats qualitatifs ou semi quantitatifs

76 76 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : IF : IMMUNOFLUORESCENCE : IF directe : détection dAg surtout IF indirecte : détection dAc surtout - Ac anti isotype - Protéine A IF sandwich Techniques dérivées : Cytométrie en flux = FACS Technique Multiplex Microscopie confocale 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

77 77 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

78 78 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

79 79 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

80 80 III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

81 81 Cytométrie en Flux = CMF –Numération des cellules exprimant un Ag au sein dune suspension hétérogène –Ac monoclonaux conjugués à des fluorochromes –Analyse multiparamétrique : taille (petits angles) granulosité (à 90°) intensité de fluorescence de plusieurs fluorochromes différents / seuil de positivité –Plusieurs milliers de cellules en quelques secondes III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

82 82 Cytométrie en Flux / Principes III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Lentille Poubelle Tube collecteur 1 Tube collecteur 2 Plaque + Plaque - LaserPhotodiode Suspension cellulaire Liquide de gaine PMT 2 PMT 1 PMT 3 Filtres dichroïques Taille (FSC) Granulosité (SSC) Filtres

83 83 Cytométrie en Flux III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS :

84 Cytométrie en Flux / Expression des résultats III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Cytogramme en 2 dimensions Sélection dune population à analyser Ly T CD8+ Ly T CD8- Ly CD8+ CD3-

85 Cytométrie en Flux III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Histogramme Histogramme avec superposition dun marquage spécifique et anticorps de contrôle (irrelevant)

86 86 Principe : Combinaison dune détection de fluorescence en cytométrie sur des billes spécifiques dun analyte. Utilisation de différentes billes, repérables chacune par leur intensité de fluorescence rouge et orange. Pour chaque type de bille on réalise un immunodosage en fluorescence dun analyte. Technique Multiplex III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : Incubation du milieu avec le mélange de billes Lavage, incubation avec le système de révélation Passage des billes sur un « cytomètre » spécifique

87 87 RIA = RADIO IMMUNOASSAY Le complexe Ag - Ac est révélé par un réactif sur le quel un radio-isotope a été fixé Marqueurs : I, 3H - Ag ou Ac marqué par un radio-isotope Révélation par comptage Sensibilité: environ 0,00001 mg/L Phase hétérogène Résultats quantitatifs III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

88 88 Méthodologies : RIA indirect : Ac Ac anti isotype Protéine A RIA compétitif : Ag et Ac RIA sandwich : Ag et Ac III. IMMUNODOSAGES AVEC MARQUEURS : 1. Principes et méthodologies de base 2. ELISA 3. Immunofluorescence 4. Radioimmunologie

89 89 IV. CONCLUSIONS : Nombreuses techniques possibles : Pièges Limites Avantages Choix de la technique en fonction de : Sensibilité Spécificité Matériel dont on dispose Prix de revient Nombre de tests Automatisation ou coup par coup Temps Nature du prélèvement Ag ou Ac Classe des Ig Rendu du résultat : qualitatif, quantitatif ou semi quantitatif …


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