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Évaluation de la toxicité dun polluant But : estimer les relations entre lexposition dun organisme à un polluant et sa réponse Tests de toxicité aiguë

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1 Évaluation de la toxicité dun polluant But : estimer les relations entre lexposition dun organisme à un polluant et sa réponse Tests de toxicité aiguë : ils ont lieu sur une courte période comparativement au cycle de vie des organismes. Ce terme est utilisé pour définir soit lexposition, soit la réponse à cette exposition. Un effet toxique aiguë est induit et observé sur une courte période d exposition Tests de toxicité chronique : ils sont réalisés pendant des expositions plus longues (10 à 20 % du cycle de vie). Les effets constatés lors dune telle exposition sont qualifiés de chroniques. Ces effets sont à relier à des changements de métabolisme, de la reproduction, de la croissance ou de laptitude à survivre. Les concentrations dexpositions sont plus faibles que ceux des test de toxicité aiguë. Les tests de génotoxicités : ils permettent de détecter la capacité dune substance ou d un processus physique à générer des dommages sur le matériel génétique.

2 Courbe théorique dose réponse : 0.1 Réponse (%) Concentration en polluant 1 NOEC LOEC Témoin CE 50 * * * * * CE 50 : dose qui affecte 50% de la population NOEC : concentration sans effet observés LOEC : plus basse concentration efficace

3 Les tests biologiques ou bioessais Procédures effectuées en laboratoire et destinées à déterminer, à laide dexpérimentations sur divers types dêtres vivants, les activités biocides et/ou les particularités toxicologiques de substances chimiques Critères dhomologation des bioessais : 1.simplicité 2.rapidité dexécution 3.reproductibilité 4.sensibilité 5.représentativité des conditions naturelles 6.coût économique le plus faible possible

4 Trois catégories principales de biotests - tests de létalité - tests sublétaux - tests à long terme - tests de reproduction - tests deffets mutagènes - tests deffets tératogènes - tests dinhibition de croissance Catégories de tests biologiques

5 Détermination des CL 50 dans des expositions à court terme (24-96 h) sur des organismes de référence (rotifères, daphnies, truitelles) Exemple de bioessais létaux en milieu aquatique test daphnie (Daphnia magna), normalisé en France par lAFNOR (NF T90 301) test truitelle (Oncorhynchus mykiss) (NF T90 305) test poisson zèbre (Brachydanio rerio) (NF T90 303) test bar (Dicentrarchus labrax) (NF T90 307) Exemple de bioessais létaux en milieu terrestre tests lombriciens : Eisenia foetida (ISO ; OCDE 207) tests insectes pour toxicité atmosphérique Les tests létaux

6 Seuil deffet : 10% Fidélité : bichromate de potassium (+) Répétitivité (même personne) Reproductibilité (labo différents) Prélèvement Conservation

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9 Exemple de bioessais sublétaux et à long terme (1) en milieu aquatique en milieu aquatique : test de croissance dalgues unicellulaires (NF T90-375) exposées à un polluant toxique à une dilution inférieure à celle provoquant la mortalité aiguë - numération au compteur ou spectrophotométrie Espèces cibles : Chlorella vulgaris, Selenastrum capricornutum test dinhibition dactivité biologique : inhibition de la bioluminescence bactérienne (sous produit de la respiration cellulaire) sur Vibrio Fischeri (Test MICROTOX) test dinhibition de la photosynthèse

10 Exemple de bioessais sublétaux et à long terme (2) en milieu terrestre en milieu terrestre : tests macroinvertébrés de la pédofaune pour toxicité des sols ou de lair isopodes (cloportes) Porcellio scaber et Oniscus asellus acarien de litière des forêts Platynothrus peltifer (métaux toxiques) collembole Folsomia candida (test normalisé à 28 jours) OCDE acariens corticoles pour biotests daéropolluants mollusques gastéropodes pulmonés (limaces, Arion ater) et escargots (Helix adserpa, H. pomatia) biotests deffets sur la reproduction plantes

11 LE TEST DE GERMINATION LE TEST DE GERMINATION En l'absence de norme concernant spécifiquement les sous-produits organiques, ce test est inspiré de la norme NF X concernant les substances chimiques solubles dans l'eau. La méthodologie du test est celle définie par la norme avec les modifications inhérentes aux produits testés (boues de STEP, composts,...), pour trois doses. Objectif : Il s'agit d'évaluer les risques d'inhibition de la germination des semences mises en contact avec différentes concentrations du produit testé. Méthodologie : Substrat : sol standard, ou sol du site d'épandage du produit étudié. Plante test : orge, cresson (NF X ), ou plante cultivée sur le sol recevant le produit. Conditions : contrôlées, en phytotron. Doses testées : 3 multiples de la dose d'épandage maximale, déterminés en fonction de la siccité du produit étudié (en général 1 fois, 2 fois et 10 fois la dose d'épandage). Durée du test : 4 à 7 jours. Paramètres mesurés : taux de germination.

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13 LE TEST DE CROISSANCE FOLIAIRE Objectif : Il s'agit d'évaluer les risques d'inhibition de la croissance des parties aériennes des végétaux supérieurs mis en contact avec différentes concentrations du produit testé. Méthodologie : Substrat : sol standard, ou Sol du site d'épandage du produit étudié. Plante test : orge, cresson, ou plante cultivée sur le sol recevant le produit. Conditions : contrôlées, en phytotron. Doses testées : 3 multiples de la dose d'épandage maximale, déterminés en fonction de la siccité du produit étudié (en général 1 fois, 2 fois et 10 fois la dose d'épandage). Durée du test :17 jours. Paramètres mesurés: matière fraîche et matière sèche des parties aériennes de la plante.

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15 LE TEST DE CROISSANCE RADICULAIRE Objectif : Il s'agit d'évaluer les risques d'inhibition de la croissance radiculaire des végétaux supérieurs mis en contact avec différentes concentrations du produit testé. Méthodologie : Substrat : sol standard, ou sol du site d'épandage du produit étudié. Plante test : orge. Conditions : contrôlées, en phytotron. Doses testées: 3 multiples de la dose d'épandage maximale déterminés en fonction de la siccité du produit étudié (en général 1 fois, 2 fois et 10 fois la dose d'épandage). Durée du test : 17 jours. Paramètres mesurés : longueur de la plus longue racine et matière sèche radiculaire.

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17 « Les toxicités » Echelle de temps Court termeMoyen termeLong et Très long terme Toxicité aiguë Toxicité chronique Toxicité génétique RISQUE VISIBLERISQUE CACHE Critères de mesure Mortalité Croissance Reproduction Altérations du patrimoine génétique CANCEROGENESE Place des effets génotoxiques parmi les différentes toxicités TERATOGENESE MUTAGENESE

18 La mutation comme événement de base pour mesurer les effets Des systèmes dalarme à court terme Des systèmes sensibles (doses sublétales) La mesure des effets génotoxiques Lésions Pré-mutationnelles Mutations ponctuelles Mutations chromosomiques

19 Tests de génotoxicités : Essais à court terme utilisés pour évaluer la génotoxicité de différents composés chimiques, deffluents ou de déchets toxiques Bioindicateurs deffets : micronoyaux Test Trad FETAX COMET assay Test de mutation génique

20 Le test COMET Seffectue sur tout type de cellules Visualisation des cassures de lADN Méthode quantitative d Tail moment = d x IF (Intensité de fluorescence dans la queue) IF

21 Plomb Témoin Temps (h) Tail moment

22 1- Les micro-noyaux Larves damphibiens : globules rouges (NF T90 327) Poissons : globules rouges Lymphocytes et érythrocytes de souris Racines de Vicia faba (NF T90 327) Deux effets : Cassures de l ADN Poisons mitotiques Test nécessitant des cellules en mitoses

23 Test MN Vicia faba AFNOR NF T Lixiviat ISO/PRF TS Les graines sont hydratées pendant 24 heures à température ambiante dans de leau déminéralisée, puis sont écossées. Les graines sont désinfectées au moyen dhypochlorite de calcium (CaClO 0,9%, 15 minutes) puis rincées à leau déminéralisée avant dêtre mises à germer verticalement, à 24°C Après 3 jours, les extrémités des racines sont coupées (5 mm environ) de façon à favoriser le développement des racines secondaires. Les graines sont alors placées au dessus dun récipient contenant le milieu nutritif préalablement oxygéné (solution de Hoagland), à 22°C. Après 5 jours, les racines secondaires peuvent être utilisées pour le test. Pour lexposition, cinq plantules sont placées dans un récipient contenant la solution dexposition, les racines étant immergées. Cinq répétitions sont mises en place pour chaque concentration. Les récipients sont placés à lobscurité et à 24 °C pendant 30 heures. Deux contrôles sont mis en place (positif et négatif) En fin dexposition, les extrémités des racines (environ 2 cm) dune douzaine de racines secondaires sont coupées et placées une nuit à 4°C dans une solution de Carnoy. Pour lobservation, les racines sont hydrolysées dans lacide chlorhydrique (HCl 1 N) pendant 6 minutes à 60°C. LADN des racines est coloré à lorcéine pendant 3 minutes à 60°C. Six racines différentes sont observées pour chaque plantule.

24 x400

25 Micronoyaux Évaluation des effets toxiques et génotoxiques de lisiers de porcs sur la base de 50 ans dépandage Micronoyaux MéthaniséBrut Mitoses 0,0% 2,0% 4,0% 6,0% 8,0% 10,0% 12,0% 14,0% Mitose Cu (ppm) Brut Méthanisé 10,16 0,17 101,66 1, ,08 8, ,58 17,28 Zn (ppm) Brut Méthanisé 1 0,500,41 105,124, ,0920, ,1741,28 Conc % Conc % Conc %

26 Induction de micronoyaux en fonction du cuivre et du zinc total dans les solutions

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28 ms TOT Témoin4,55 Lisier brut 2,62 Lisier méth 4,10

29 Développement dun test MN en sol contaminé par des HAP Développement d1 méthode en sol

30 Résultats – Méthode normalisée et micro-culture -> Méthode normalisée (expo 24 heures en hydroponie) -> pas deffet des sol contaminée en HAP

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32 Résultats – Méthodes en sol -> Détermination de la durée dexposition Toxicité et hétérogénéité des résultats après 5 jours => Résultats à 2 jours

33 Table 2 : Chemical analysis of soils and aqueous extracts from soils collected on industrial sites A and B

34 Résultats – Méthodes en sol -> Effet dose (2 jours dexposition) Génotoxicité du sol Sensibilité de loutil (réponse différente de lhydroponie et lien dose-réponse)

35 Tradescantia paludosa Test trad

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37 Pink mutation

38 Sample of 1 mutation event (photo at left) and the standard mutation scoring sheet (table on the right)

39 Inflorescences : période optimale dexposition des plantes aux polluants

40 Chambre à gaz équipé de systèmes de contrôles Plantes exposé en milieu urbain

41 In situ water pollution monitoring device Aquatoon, a floating device

42 Cycle de développement dun amphibien urodèle Cycle de vie principalement inféodé au milieu aquatique (jeunes stades de développement = les plus sensibles) Œufs sans coquilles, puis têtards munis de branchies Larves à la peau très fine Animaux sédentaires, évolution des conditions locales AMPHIBIENS = Très bons indicateurs de la santé des écosystèmes aquatiques et très bons modèles détude cytogénétique Grande quantité dADN répartie dans un petit nombre de chromosomes Cellules Érythrocytaires de grande taille Utilisation du modèle amphibien

43 Une méthode standardisée au niveau National et International Normalisation AFNOR T (2000) Normalisation internationale ISO (2006) 3 espèces concernées : 2 urodèles Axolotl et Pleurodèle, 1 anoure Xénope Xenopus laevis Protocole simplifié des essais Lessai des micronoyaux sur les larves damphibiens Taux pour mille de cellules micronucléées Micronoyaux Ambystoma mexicanum 1-Production des larves -Fécondation in vivo ou in vitro (HGC) -Elevage des embryons et des larves Jusquau stade dutilisation dans lessai 2-Exposition des organismes (12 j) - Essai préliminaire de toxicité - Essai définitif de génotoxicité Renouvellement quotidien des solutions dessai 3-Prélèvements sanguins 4-Lecture/analyse des résultats Pleurodeles waltl

44 3- test FETAX (Frog Embryo Teratogenesis Assay Xenopus) But : déterminer les malformations, la mortalité et linhibition de croissance des embryons soumis aux xénobiotiques (Dumont 1983, USA) Test utilisé pour lessai de substance seule ou en mélange - Solvants industriels - pesticides - eaux de surfaces et nappes phréatiques - extraits de sédiments - effluents de procédés de traitement des eaux Le test débute après la segmentation (stade blastula-début gastrula) : stade 8 xénope Le test fini après lorganogenèse : stade 47 (5J)

45 Modalités du protocole : test in vitro Mâles sont endormis (tricaïne méthane sulfonate) Prélèvement des testicules conservation en solution de Barth Inhibition de la mobilité des spermatozoïdes Femelles reçoivent 450 UI gonadotrophine (veille de lexpérience) Ponte répartition des œufs Mélange + solution FETAX restaure la mobilité des spermatozoïdes et la fertilité des œufs (8h à 22°C) Fin du stade blastula (début du test, 5j à 23°C)

46 Séléction des œufs (8x2/traitement) Dénombrement des larves vivantes (battements cardiaques) Anesthésie Observation des larves - mesure de la taille des larves vivantes et non mal formés - analyse des malformations Mesure de la concentration létale (CL50) à 120h Mesure de la concentration tératogène (CT50) à 120h Indice de Tératogénicité = CL50 TC50 IT<1.3 non tératogène 1.3 < IT < 2 faiblement tératogène 2 < IT < 3 modérément tératogène IT>3 hautement tératogène

47 - Mutations géniques : Nicotina tabacum Nicotiana tabacum Caractère (necrotic character) gène N Nicotiana tomentosiformus (2n =24) Nicotiana sylvestrus (2n =24) Le gène N (homozygote) confère lhypersensibilité au VMT Nicotiana glutinosa (résistante à tous les virus par nécrose) Nicotiana glutinosa X Nicotiana tabacum F1 (N/n) F1 X F1 N/N (caractéristiques du tabac, Nicotiana tabacum xanthi n.c) Traitement des graines par Éthyle méthane sulfonate : Plan M 1 de N. tabacum avec secteurs sur feuilles vert/jaune (J 1 )

48 Pour comprendre les variations de caractère : régénération de plantes entières à partir du fragment de limbes présentant des variations somatiques Cultures primairesNéo-formation de bourgeonsNéo-formation de racines Plante néo-formée (étude la descendance) Existence dune relation entre le phénotype V/J et la structure hétérozygote de deux gènes non liés : a 1 et a 2. a 1 + / a 1 et a 2 + / a 2 déficience chlorophyllienne partielle Décoloration = blocage de la synthèse de lamelles thylacoïdiennes Étude de la descendance coopération fonctionnelle entre a 1 + et a 2 +

49 a 1 + a 1 + a 1 a 1 a 2 + a 2 + a 2 a 2 V 1 V 2 V 3 V J 1 J 3 J 2 J µg chlorophylle / g PF Coopération fonctionnelle entre a 1 et a 2 a 1 est fonctionnel et antagoniste de a 1 + et a 2 + a 2 est amorphe Génotype a 1 + / a 1 a 2 / a 2, greffé sur le type vert a1+/ a1 a2+/ a2 Agents mutagènes réversion ou mutation du gène a 1 rétablissement de la synthèse chlorophyllienne

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53 Conclusion Un grand nombre de tests peuvent permettre dévaluer a priori laction de molécules : Toxicité aiguë, Génotoxicité, métabolisme, Tératogénicité, perturbateurs endocriniens… Ces test ne peuvent entièrement prévoir les risques à long terme pour lenvironnement - différentes interactions possibles entre polluant et milieu - difficile de prévoir la réaction dune espèce animale particulière dont dépend une chaîne trophique Synergie ou antagonisme entre différentes molécules Nécessité de recherche a posteriori afin de suivre lévolution de la qualité du milieu et son impact sur le vivant en utilisant différents bio-marqueurs Marqueurs de « stress » in situ à différent niveau dorganisation du vivant Couplage avec des analyses chimiques


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