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Protéomique Schizosaccharomyces pombe Protéome = ensemble des protéines dune cellule,

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1 Protéomique Schizosaccharomyces pombe Protéome = ensemble des protéines dune cellule, ou dune organelle, à un instant donné (et donc sous des conditions données) Connaissance du génome nimplique pas la connaissance du protéome (régulation de la transcription, de la traduction, de la localisation cellulaire, etc.) Connaissance du transcriptome nimplique pas la connaissance du protéome (régulation de la traduction et de la localisation cellulaire, durée de vie des protéines, etc.)

2 Protéomique Protéome = ensemble des protéines dune cellule, ou dune organelle, à un instant donné (et donc sous des conditions données) Génome = ensemble des gènes dun organisme, ou dune espèce Y-a-t-il un parallèle complet entre génomique et protéomique ?

3 Génome versus Transcriptome et Protéome

4 Protéomique Protéome = ensemble des protéines dune cellule, ou dune organelle, à un instant donné (et donc sous des conditions données) Génome = ensemble des gènes dun organisme, ou dune espèce Y-a-t-il un parallèle complet entre génomique et protéomique ? Génome : taux derreur de la réplication, ~10 -7 modifications de la chromatine (méthylation, etc.) Protéome : taux derreur de la transcription, erreur/polymorphisme de lépissage erreur/polymorphisme de lédition erreur de la traduction, repliement modifications post-traductionnelles (irréversible/réversibles) localisation cellulaire

5 Électrophorèse 2D

6 Electrophorèse 2D

7 DIFFÉRENTES VISIONS DE LA PROTÉOMIQUE Protéomique fonctionnelle : interactions protéines-protéines (double-hybride, PCA, Tap-Tag MS-MS, etc.), etc. Protéomique structurale : structure tridimensionnelle de toutes les protéines (cristallographie, RMN, etc.) Pharmacoprotéomique Etc. --> description de toutes les protéines à un instant t en utilisant la spectrométrie de masse

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15 Le peptide trypsique NH 3 + C C R1 O NH C C R2 O C C R3 O NH C C O OH CH 2 (CH 2 ) 3 NH 3 + Se termine par une Lysine ou une Arginine donc 2 sites basiques protonables par peptide : le NH 2 terminal et le NH 2 de la chaîne latérale de la Lys ou de lArg Lysine coursenligne.u-strasbg.fr/depotcel/DepotCel/279/Intranet/Carapito.ppt

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19 Désorption-ionisation laser assistée par matrice Matrix-Assisted Laser Desoption/Ionisation (MALDI)

20 Avantages : * Possibilité d'ioniser des molécules de hautes masses moléculaires * Méthode d'ionisation douce : peu de fragmentation des ions moléculaires * Permet d'analyser des échantillons de faible concentration (de l'ordre de la picomole ( ) et de la femtomole ( ) ) * Produit principalement des ions monochargés, spectre plus simple à analyser * Grande tolérance aux sels et aux tampons Tampon et selsMasse molaire (en g/mol) Concentration maximale compatible avec le MALDI (en mM) Tris HEPES Bicine16350 Urée60500 Guanidine96250 DTT Glycérol92130 PEG ,5 Triton X ,6 NP ,7 SDS2880,35 Inconvénients : * Formation d'adduits (combinaison directe de 2 espèces chimiques distinctes) et d'ions de matrice Désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI)

21 Ionisation par électrospray Electrospray Ionisation (ESI) Pression élevée Pression faible [M+nH] n+ n pouvant aller jusqu'à plusieurs dizaines m/z = (M+3)/3, (M+4)/4, (M+5)/5, (M+6)/6 Avantages : molécules en solution La multicharge permet létude de molécule de plus haut poids moléculaire que la limite de l'analyseur Inconvénients : complique l'analyse de spectre

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23 m étant la masse v la vitesse l la distance parcourue pendant le vol t le temps de vol z la charge de lion V la tension accélératrice e étant la charge élémentaire Temps de vol Time Of Flight (TOF)

24 Le temps de vol L'analyseur quadripolaire Le piège ionique quadripolaire Le FT-ICR L'orbitrappe L'analyseur à secteur magnétique

25 Chambre d'ionisation Jonction au silicium Scintillateur Cage de Faraday Détecteur à induction Multiplicateur d'électrons Détection dans un spectromètre de masse à résonance cylcotronique Détecteur hybride Détecteur cryogénique Détecteur en spectrométrie de masse + grande diversité de fabricants Multitudes de types dinformation et de formats de fichier

26 Spectrométrie de masse en tandem

27 CH R 1 R 2 CO NH a b c x y z 2 CH CO NH CH COOH R 3 CH 2 v w d Règles de fragmentation des peptides Biemann, 1990 Ions de série a, b et c : charge positive portée par la partie N-terminal Ions de série x, y et z : charge positive portée par la partie C-terminal Ions de série d, v et w : fragmentation des chaînes latérales Fragmentations basse énergie Fragmentations haute énergie Biemann K., Appendix 5, Nomenclature for peptide fragment ions (positive ions), Methods Enzymol, 1990, 193, coursenligne.u-strasbg.fr/depotcel/DepotCel/279/Intranet/Carapito.ppt

28 + ALLLFSDGR + Fragmentation des peptides : La loi du proton mobile + ALLLFSDGR + Fragmentation dans la cellule de collision Les peptides ne cassent qu'une seule fois pour générer préférentiellement les fragments y et b + ALLLFSDGR + Dongré et al., Journal of Mass Spectrometry, Vol. 31, (1996) +A+A + AL + ALL + ALLL + ALLLF + ALLLFS + ALLLFSD + ALLLFSDG Fragments b LLLFSDGR + LLFSDGR + LFSDGR + FSDGR + SDGR + DGR + GR + R+R+ Fragments y coursenligne.u-strasbg.fr/depotcel/DepotCel/279/Intranet/Carapito.ppt

29 En abscisse, le rapport masse/charge ; en ordonnée, le pourcentage des ions possédant une masse donnée. En pratique, seul l'espacement entre les pics est interprété, pas leur hauteur. En interprétant ces espacements, il est possible de reconstituer la séquence peptidique. Sur cet exemple, la lecture du spectre de droite à gauche permet de reconstituer la séquence EWMPGQPR Exemple de spectre MS/MS

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31 Peptide Mass Fingerprint Cut out 2D-Gel Spot Concentrations as low as 10 femtomoles ( )

32 Peptide Mass Fingerprint Trypsin Digest

33 Peptide Mass Fingerprint MS

34 Peptide Mass Fingerprint

35 Protein Sequence Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG

36 Protein Sequence Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG

37 Peptide Masses GLSDGEWQQVLNVWGK VEADIAGHGQEVLIR LFTGHPETLEK HGTVVLTALGGILK KGHHEAELKPLAQSHATK GHHEAELKPLAQSHATK YLEFISDAIIHVLHSK HPGDFGADAQGAMTK ALELFR

38 Peptide Mass Fingerprint GLSDGEWQQVLNVWGK VEADIAGHGQEVLIR LFTGHPETLEK HGTVVLTALGGILK KGHHEAELKPLAQSHATK GHHEAELKPLAQSHATK YLEFISDAIIHVLHSK HPGDFGADAQGAMTK ALELFR

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40 Sensitivité versus spécificité Sensitivité : identifier le plus de protéines (le moins de faux négatifs) Spécificité : identifier le plus de vrais positifs PLOS Comp. Biol. (2008) 4:e12

41 Le Dalton est une unité de masse qui correspond à peu près à la masse dun atome dhydrogène. Exprimé en g, 1 Da correspond à environ 1, g. Petit rappel Glycine75 Alanine89 Sérine105 Proline115 Valine117 Thréonine119 Cystéine121 Isoleucine131 Leucine131 Asparagine132 Aspartate133 Glutamine146 Lysine146 Glutamate147 Méthionine149 Histidine155 Phénylalanine165 Arginine174 Tyrosine181 Tryptophane204 Précision de la spectrométrie de masse : 0,1 dalton à 10 daltons Modifications post-traductionnelles Acétylation33 Méthylation15 Glutamylation146 Glycylation75 Glycosylation>30 Isoprénylation>100 Phosphorylation95

42 Digest with specific protease Trypsin (K, R; not followed by P) Chymotrypsin (F, W, Y, L, M) Lys-C (K) Arg-C (R) Asp-N (D, N-terminal) V8-bicarb (E) V8-biphosph (E, D) {CNBr (M)}

43 Digest with specific protease Why trypsin? High specificity (K or R, not followed by P) Acetylated form commercially available (acetylation lessens autodigestion) Autolysis peaks are great internal calibrants ( and ) ( ), guanidinated

44 Digest with specific protease >RBME00320 Contig0311_ _ EC-mopA 60 KDa chaperonin GroEL MAAKDVKFGR TAREKMLRGV DILADAVKVT LGPKGRNVVI EKSFGAPRIT KDGVSVAKEV ELEDKFENMG AQMLREVASK TNDTAGDGTT TATVLGQAIV QEGAKAVAAG MNPMDLKRGI DLAVNEVVAE LLKKAKKINT SEEVAQVGTI SANGEAEIGK MIAEAMQKVG NEGVITVEEA KTAETELEVV EGMQFDRGYL SPYFVTNPEK MVADLEDAYI LLHEKKLSNL QALLPVLEAV VQTSKPLLII AEDVEGEALA TLVVNKLRGG LKIAAVKAPG FGDCRKAMLE DIAILTGGQV ISEDLGIKLE SVTLDMLGRA KKVSISKENT TIVDGAGQKA EIDARVGQIK QQIEETTSDY DREKLQERLA KLAGGVAVIR VGGATEVEVK EKKDRVDDAL NATRAAVEEG IVAGGGTALL RASTKITAKG VNADQEAGIN IVRRAIQAPA RQITTNAGEE ASVIVGKILE NTSETFGYNT ANGEYGDLIS LGIVDPVKVV RTALQNAASV AGLLITTEAM IAELPKKDAA PAGMPGGMGG MGGMDF 546 aa60 kDa; Da pI = 4.75

45 Digest with specific protease Trypsin yields 47 peptides (theoretically) Peptide masses in Da:

46 Digest with specific protease Trypsin yields 47 peptides (theoretically) Peptide masses in Da:

47 Théorie et Pratique Supposant que lon connaisse la séquence exacte, on peut prédire une liste de peptides (et leur masse), mais on va en voir moins par MS Digestion incomplète : ¤ enzyme nest pas parfait (e.g. trypsine coupe moins bien quand un a.a. basique est adjacent au site de clivage) ¤ empêchement st é rique ¤ cin é tique Peptides perdus au cours de lexpérience : ¤ lavages ¤ mauvaise ionisation Peptides supplémentaires : ¤ contaminations ¤ clivage non spécifique ¤ modifications (e.g. oxydation de la méthionine)

48 Digest with specific protease Trypsin yields 47 peptides (theoretically) Peptide masses in Da:

49 Fragfit : une approche simple Fragfit (PNAS, 1993, 90: Requiert une liste de peptides (et leur masse) et une base de données de séquences protéiques 2.Calcule, pour chaque protéine, la liste théorique 3.Calcule, pour chaque protéine, le nombre de peptides qui matchent (en fonction dun seuil défini a priori) 4.Donne la liste des protéines par ordre décroissant de nombre de matches Seulement une protéine avec 5 matches parmi > protéines Journal of the American Society for Mass Spectrometry (2003) 14: Quel seuil choisir ? Favorise les grosses protéines (e.g. titine, 3 Mda) Remplacer le nombre de fragments trouvés par la fréquence des fragments trouvés

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60 MASCOT, une approche probabiliste Perkins et al. (1999) Electrophoresis 20: Définir un modèle et calculer la probabilité quun spectre correspond à une protéine particulière Distribution a priori de la taille des peptides en fonction de la taille de la protéine Probabilité de non coupure par la protéase Probabilité de modifications post-traductionelles ou chimiques (en particulier des extrémités N et C terminales) Précision de la mesure de la masse (intervalle)

61 MASCOT, une approche probabiliste Avantages : Fournit naturellement une e-value Corrige naturellement pour la taille des protéines Inconvénients : Temps calcul Limitations du modèle

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63 Génome versus Transcriptome et Protéome

64 Quelles améliorations ? Fournir des informations supplémentaires (taille de la protéine, pI, etc.) Utiliser une banque de spectres pré-établis plutôt qu une banque de s é quences (suppose que le spectre est assez reproductible) Développer des statistiques permettant de garder le taux de faux positifs en dessous de e.g. 5% Filtrer les spectres de masse a priori pour éliminer les contaminants Utiliser des distributions plutôt que des intervalles pour prendre en compte l erreur de mesure Identifier des m é langes de prot é ines (cadre Bay é sien) Approche consensus S é quen ç age ( é tiquette - 3 a.a. - ou ensemble du fragment)


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