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DEN / DRCP 1 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Atelier PARIS 7-8 Avril 2004 " Bases de données " Intérêt des bases de données pour la spéciation.

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1 DEN / DRCP 1 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Atelier PARIS 7-8 Avril 2004 " Bases de données " Intérêt des bases de données pour la spéciation des actinides en milieu biologique Application à la toxicologie nucléaire E.Ansoborlo V.Moulin, C.Moulin, L.Bion, P.Moisy, C.Madic, G.Cote Programme de Toxicologie Nucléaire

2 DEN / DRCP 2 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Plan de l’exposé 1. Etudes dans le domaine de la Toxicologie Nucléaire 2. Besoins de spéciation en Biologie 3. Etat des connaissances Actinides-Biologie 4. Eléments et milieux d’intérêts 5. Groupe de travail CETAMA GT 32 "Spéciation" 6. Exemples d’application 7. Perspectives

3 DEN / DRCP 3 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 1. Etudes dans le domaine de la Toxicologie Nucléaire Domaine d’étude : Radiotoxicité (hors radiobiologie) Dosimétrie InterneToxicité chimique Eléments d’intérêt : Actinides, PF, PA Modèles CIPR Programme ToxNuc-E

4 DEN / DRCP 4 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 1.1 Modes de contamination : CIPR Incorporation Métabolisme Organes cibles Excrétion

5 DEN / DRCP 5 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 1.2 Programme de Toxicologie Nucléaire Programme inter organismes (CEA-CNRS-Inserm-Inra) Programme multidisciplinaire : physique, chimie, biologie, biochimie, médecine… 2 orientations : Homme et Environnement • Cibles moléculaires des actinides • Toxico-cancéro,neurotoxicité, génotoxicité • Décorporation des actinides • Transporteurs membranaires, stress oxydant • Spéciation en milieu biologique

6 DEN / DRCP 6 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg ADN Mécanismes de protection/ detoxication Regulation génétique Effets sur physiologie cellulaire réponses Précoces/ tardives élément chimique transporteur ? protéines Molecules cibles Toxicité chimiqueToxicité radiologiqueet /ou MOX U+Pu macrophage pulmonaire Niveau cellulaire Spéciation

7 DEN / DRCP 7 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 2. Besoins de spéciation en Toxicologie Nucléaire • Dimensionner les expérimentations • Comprendre les mécanismes de transfert ou rétention • Préparer et interpréter les études Décorporation

8 DEN / DRCP 8 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 3. Etat des connaissances Actinides-Biologie

9 DEN / DRCP 9 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 3.1 Bases de données existantes • Radionucléide Database (Inhalation, ingestion…) : Données biocinétiques( absorption sang, ingestion…) • Base de données décorporation ( en cours DSV/CARMIN ) Familles de ligands, efficacité décorporante, Cst… • Base de données toxicologiques (DEN/DSV) : comparaison Toxicologie/radiotoxicologie

10 DEN / DRCP 10 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 4. Eléments et milieux d’intérêts Eléménts • Actinides (Th, U, Np, Pu, Am…) • PF (Cs, Sr, I, Tc, Se…) • PA (Co, Ni…) • Toxiques (Cd, Be…) Milieux • Sang • Salive • Sucs Gastriques • Urine • Lait Mat-fœtal • Macrophages… • Milieux Culture Familles ligands • Minéral • Organique • Acides aminés, Protéines • Sucres • Cations base • décorporants Paramètres variants : C, pH, I, Redox +précipitation

11 DEN / DRCP 11 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Exemples de composition de milieux d’intérêt

12 DEN / DRCP 12 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Acide de Lewis (Pearson) Hg Cd Ag Cu(I) Pb Zn Cu(II) Co Fe(II) Fe(III) Mn Ca Mg Cs Sr U cations mous cations dursintermédiaires Thiolates (S)Carboxylates (O) Carbonyles Imidazoles (N) Acides aminés protéines Acide aspartique Acide glutamique Glycine, Tyrosine… Transferine… Cystéine Glutathion Metallothionéine… Cahier des charges Métal/ligand

13 DEN / DRCP 13 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Cahier des charges Actinides/ligands Contraintes Actinides • Cations durs (Pearson) • Degrés d’oxydation 3 à 6 (Am 3+, Np 4+, NpO 2 +, Pu 4+, UO 2 2+ ) • Aptitude hydrolyse M 4+ > MO 2 2+ > M 3+ > MO 2 + • Redox (ex : Np(IV), Np(V)) • Nombreux complexes (OH-, H 2 PO 4 -, HCO 3 - ) • Cinétique de dissociation des complexes stables lente Ligands • Atomes donneurs O>N>S • Denticité ou Nb de sites donneurs • Stéréochimie du ligand, taille • Stabilisation (liaisons H) • Sélectivité/(Na +, Ca 2+ …) • Ionisé au pH physiologique • Hydrosoluble • Cinétique et thermodynamique • Ratio Chelatant:métal (>1000:1) • Toxicité et AMM (autorisation)

14 DEN / DRCP 14 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 5. Groupe de travail CETAMA GT 32 "Spéciation" • Crée en 2000 avec 2 sous-groupes • Bases de données (L.Bion, G.Cote) • Méthodologie (D.Doizi) • Objectifs • Incrémenter Bases de données (BASSIST) • Organisation d ’exercices intercomparaisons • Production 1 Note technique " Spéciation "/an • Réalisations • Bases de données : U, Pu, Am, Np • Notes techniques "Spéciation" : U, Pu, Co, Tox • Production 1 Note technique Spéciation/an • Workshop (2001, 2004), Publication (RCA)

15 DEN / DRCP 15 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 5.1. Etat des lieux données : ex Actinides Sources • NEA/OCDE • PSI • IUPAC • Smith-Martell • NIST • IRSN • Publications Familles ligands • Minéral • Organique • Acides aminés, Protéines • Sucres • Cations base • décorporants • OH -, HCO 3 -, HPO 4 =, SO 4 = … OK • Citrates… (Expertise) • Données (Exp) manque données • manque données • Données (OK) • qq données (Exp) Etat des données

16 DEN / DRCP 16 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 5.1. Etat des lieux données : ex Actinides

17 DEN / DRCP 17 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 6.1. Exemple d’application des bases de données • Spéciation des actinides dans le sang • Précipitation intracellulaire de l’uranium (rein) • Répartition différente de 3 espèces Pu (foie)

18 DEN / DRCP 18 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Spéciation actinides dans le sang U Am 3+ Pu 4+ Np0 2 +

19 DEN / DRCP 19 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Spéciation actinides dans le sang Pu 4+ Np 4+ Th 4+ Np0 2 +

20 DEN / DRCP 20 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Précipitation intracellulaire de l’U (rein) Uranium sous forme bicarbonate [U]=8x M Précipités d’uranium / cellule LLC-PK 1 (x 80000) Spectre analyse X (EDAX) Uranium Phosphore Spéciation théorique

21 DEN / DRCP 21 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Pu-cit 239Pu-nit 239Pu-phyt Temps (jours) % activité injectée Rétention hépatique de différentes formes chimiques de Pu au cours du temps après contamination I.V.

22 DEN / DRCP 22 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 6.2. Exemple de détermination de Constantes thermodynamiques • Spéciation du Neptunium dans le sang • Décorporation de l’U par un Biphosphonate (EHBP) • Système Cobalt-citrate, cobalt-cystéine

23 DEN / DRCP 23 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Exemples Cas du Neptunium (thèse R.Racine, Paris XI, 2001) • Nombreuses manip in vivo sur Np(IV) et Np(V) • Dans le sang Np sous 2 formes • NpO 2 + libre + NpO 2 HPO NpO 2 CO 3 - • Np 4+ lié à la transferrine (log K1~22) • Dans l’os sous 1 forme :Np 4+ • Np 4+ lié hydroxyapatite Np 4+ en milieu citrate partiellement oxydé Np 4+ Np0 2 +

24 DEN / DRCP 24 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Np 4+ NpO 2 + Cas du Neptunium (thèse R.Racine, Paris XI, 2001)

25 DEN / DRCP 25 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Caractérisation du complexe UO EHBP - Possède une AMM (maladie de Paget) - Nombreuses études biologiques : Hoffschir (2000) Hengé-Napoli (1999) Ubios (2001) - Famille des diphosphonates

26 DEN / DRCP 26 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Confirmation de la stœchiométrie du complexe 1 : 1 m/z = [(UO 2 )(H 3 L)(ClO 4 ) 2 ] - pH 2 m/z = 679 [(UO 2 )(H 2 L)(H 3 L)] - pH 4 Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH 3 L log  = 6.0 ± 0.4 MH 2 L log  = 11.0 ± 0.6 ESI-MS SLRT Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH 3 L log  = 6.0 ± 0.6 En accord avec Nash * log  = ± 0.01 (extraction) * Nash K. L. Radiochimica Acta 1993, 61, 147. Titratio n à pH = 2 [UO 2 2+ ] = M [EHBP] = 0 à 5 équiv. Complexe UO EHBP par ES-MS

27 DEN / DRCP 27 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Matrice biologique Sang, peau, foie Etudes cellulaires in vitro  Toxicité du Co sur les kératinocytes  Spéciation du Co dans les lignées d’hépatocytes (prgm décorporation) Matrice environnement Sol, plantes, systèmes aquatiques….  Fixation du 57 Co dans les sols  Phytoextraction de cellules végétales (prgm transfert sol plantes) Système Cobalt-citrate, cobalt-cystéine Matrices simples pour étude fondamentale via plate forme spectroscopique Co-Citrate, Co-Cystéine, Co-EDTA (référence)

28 DEN / DRCP 28 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg + Etude en ES-MS et CI-ICP/OES: Stoechiométrie 1/1 • Confirmation de la constante de complexation Co(II)/Cit: Log  1 = 4.5  0.4 • Pas d’observation du complexe Co-Cit en raison de son caractère labile  Résultats en accord avec la littérature (A. A. Ammann, J. Chromatogr. A, 2002, 947, 205) Le ligand citrate: acide organique + Ligand très abondant dans les milieux biologiques et environnement • Sang : M • Solubilisation des métaux : transport et biodisponibilité + Peu de données concernant le système Co-Cit (1/1) en milieu aqueux pKa 1 = 3.14 pKa 2 = 4.77 pKa 3 = Utilisation sous forme d’acide citrique

29 DEN / DRCP 29 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Le ligand cystéine: acide aminé + Rôle important dans la structure des protéines via sa fonction SH + Peu de données récentes concernant le système Co-Cyst (1/1) en milieu aqueux pKa (COOH) = 1.82 pKa (SH) = 8.24 pKa (NH 3 + ) = Activation sélective des sites: étude en fonction du pH + Phénomènes rédox inhérents au couple Co 3+ /Co 2+ DH 2 Présence de O 2 : oxydation de la cystéine 2RSH RSSR + 2H + + 2e - (favorisée en milieu basique) + Etude en ES-MS: Stoechiométrie 1/1

30 DEN / DRCP 30 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg Etude du système Co – cystéine "La spéciation du Co dans le domaine de la toxicologie nucléaire: milieux environnementaux et biologiques". NT CETAMA E. Ansoborlo et al. Co(II) libre Co(II)Cyst Spéciation par ES-SM Co(II)DH2 Co(III)Cyst2 • Complexe 1-1 avec la cystéine majoritaire à pH5 • Complexe avec la cystine (dimère) à pH neutre • Complexe 1-2 avec oxydation de Co à pH basique Diagramme obtenu expérimentalement % des espèces A intégrer dans les outils de spéciation théorique type JCHESS

31 DEN / DRCP 31 Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg 7. Perspectives • Programme ToxNuc-E : plateforme spéciation Thèse Np-Pu/transferrine aspect redox ( P.Moisy, 2004 ) Thèse Pu-protéines ES-MS (C.Moulin, 2004) • Poursuite travaux GT 32 : intercomparaison Tc Note spéciation Np Publi intercomparaison Am (L.Bion) Intercomparaison solution U, phosphates, citrates • Participation CDTP école des mines • Organisation 2 ème Workshop spéciation Institut Curie (15-16 Novembre 2004)


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