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Techniques immunologiques A) Propriétés du complexe anticorps/antigène Plan du cours Ouchterlouny et Immuno-electrophorèse Immunodiffusion "Ag" ou d'anticorps.

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1 Techniques immunologiques A) Propriétés du complexe anticorps/antigène Plan du cours Ouchterlouny et Immuno-electrophorèse Immunodiffusion "Ag" ou d'anticorps soluble: ELISA et Westernblot Immunodétection IgE: RIST et RAST "Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux (Facs) B) Propriétés du complément CH50 C) Réponses lymphocytaires Détection de complexes immuns: test au C1q Test de lymphoprolifération aux mitogènes Test de culture mixte

2 A) anticorps/antigène Immunodiffusion anticorps + antigène +++ anticorps++ antigène ++ anticorps+++ antigène + équivalence Précipitation Ac polyclonal Ac monoclonal

3 Visalisation sur gel (bleu de comassie) Immunoélectophorèse Ouchterlony Immunodiffusion A) anticorps/antigène anticorps+antigène précipitation

4 Ouchterlony Équivalence: précipité bleu Sensibilité: µg/ml

5 Ouchterlony •Intérêt surtout historique (savoir que c’est une technique basée sur la diffusion et la précipitation mais les détails ne sont pas matière d’examen) •Permet la comparaison directe de différents antigènes (par exemple les déterminants antigéniques de l’albumine de deux espèces voisines sont-ils différents ou partiellement semblables?)

6 Ouchterlony •Un puits central dans lequel on introduit les anticorps (aussi appelés antisérum) •Des puits périphériques équidistants dans lesquels on introduit les antigènes à évaluer •Si une seule protéine (ou un seul polysaccharide) est reconnu par l’antisérum : 1 bande; si deux protéines de PM différents sont reconnues : 2 bandes –La bande la plus proche du puits central correspond à l’antigène qui a migré le plus vite (qui est donc le plus petit)

7 Ouchterlony •Si on dépose des préparation différentes dans les puits périphériques, on compare les courbes de précipitation en regard de chaque puits périphérique •Lorsqu’on dépose la même protéine (ou le même polysaccharide) dans deux puits adjacents, les traits de précipitation vont se rejoindre : c’est la réaction d’identité

8 Ouchterlony •Si deux protéines (ou polysaccharides) différents mais partageant un déterminant antigénique sont introduites dans deux puits périphériques adjacents, les traits de précipitation fusionnent mais on note une projection qui prolonge le précipité formé par la réaction principale : cette projection est due à des anticorps qui reconnaissent des déterminants antigéniques qui ne sont pas présents dans les deux solutions : c’est la réaction d’identité partielle

9 - F(ab) -  chains -  chains - Fc from IgG with  chains - A mixture of  heavy and  chains -  chains Quizz: Ouchterlony

10 Réponses au Quizz (just for the fun) •1 Fab : identité partielle avec 2 •2. Chaînes  –Identité avec ligne externe de 3 •3. Mélange de chaînes  et de chaînes légères  –deux bandes distinctes car les protéines ont des PM différents et ne diffusent pas de la même façon •La ligne la plus proche du puits central : k (identité avec 4) •L’autre ligne : la protéine la plus lourde g •4. Chaînes  –Absence d’identité avec 5 –Réaction d’identité avec une des protéines 3 •5. Chaînes  –Reconnaissance mais absence d’identité avec 4 •6. Portion Fc d’une IgG possédant des chaînes  –Aucune reconnaissance (pas de bande)

11 Quizz: Ouchterlony

12 Immunodiffusion A) anticorps/antigène Immunoélectrophorèse Mélange d'antigènes trop complexe (beaucoup de molécules de poids moléculaires très voisins) Séparation des Ag selon leur charge avant d’être détecter par précipitation

13 Technique qualitative peu sensible (>100µg/ml) Immunoélectrophorèse Puits contenant la mixture d'Ag Déplacement des ≠ Ag Diffusion des Ac

14 Détection d’immunodéficience: faible quantité d’un ou plusieurs isotypes Détection Immunoglobulines Albumine Transferrine Sérum (IEP-sérum) ou urine (IEP-urine) Utilisation: Immunoélectrophorèse Immunoglobulines Polyclonal ou monoclonal

15 IgG IgM Enzyme/Chromogène A) anticorps/antigène Immunodétection Radioactif Fluorescence

16 A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble ELISA Westernblot Sérum Urine Surnageant de culture Etc.

17 A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay Enzyme/Chromogène

18 ELISA Exemple: détection d'Ac anti-HIV Résultat Sensibilité: pg/ml

19 ELISA ELISA sandwich Ac de capture Détection Ac Détection Ag

20 A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" ou d'anticorps soluble Westernblot Séparation des ≠ Ag par électrophorèse sur gel Détection par Ac (présent dans le sérum du patient) Exemple: détection des faux positifs HIV (détecté par Elisa) Détection de Ac par un Ac marqué

21 Westernblot Exemple: détection d'Ac anti-HIV Résultat Pos patients Neg Protéines HIV Patient A: négatif Patient B: indéterminé Patient C: positif

22 A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe et en flux Immunohistochimie Cytométrie en flux (FACS)

23 A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Principe indirecte directe

24 A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: marquage actine, tubuline et noyau

25 •Maladie de Goodpasture (dépôts linéaires d’IgG et de C3b)

26 A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: infiltration CD4 dans une tumeur NégPos

27 A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules : sur coupe Exemple: marquage Fas Nég Pos

28 A) anticorps/antigène Immunodétection Présence d'anticorps "anti-soi" Sérum patient Anticorps anti-nucléaire Cellules test

29 A) anticorps/antigène Immunodétection Présence d'anticorps "anti-soi" Anticorps anti-nucléaire

30 A) anticorps/antigène Immunodétection "Ag" liés aux cellules en flux Cytométrie en flux FACS = fluorescence activated cell sorter

31 A) anticorps/antigène Immunodétection Principe indirectedirecte Cytométrie en flux (FACS)

32 FACS 3000 cellules/sec

33 FACS Sang Taille "granulosité"

34 Th Tc FACS Sang Fluorescence verte Fluorescence orange

35 Coupe: Avantages et inconvénients Facs versus coupe Rapidité d'analyse Multi-couleurs Possibilité de tri FACS: Localisation Interaction entre ≠ cellules

36 Atopie A) anticorps/antigène Immunodétection IgE: RIST et RAST

37 A) anticorps/antigène Immunodétection IgE: RIST RIST = radioimmunosorbent test quantification des IgE totales

38 A) anticorps/antigène Immunodétection RIST = quantification des IgE totales

39 A) anticorps/antigène Immunodétection IgE: RAST RAST = radioallergesorbent test quantification des IgE spécifiques

40 A) anticorps/antigène Immunodétection RAST = quantification des IgE spécifiques

41 Le complexe C1 A) anticorps/antigène Immunodétection Test au C1q

42 •La liaison de C1q à deux Ig ou plus n’est possible que si ces dernières appartiennent à un même complexe immun ou si elles sont fixées sur une même surface

43 A) anticorps/antigène Immunodétection Test au C1q C1q Complexe immun Ac libre

44 B) Propriétés du complément CH50 Mesure l'activité fonctionnelle du complément

45 C3 C3b C5-C9 Lyse de la cellule cible Voie classique C1, C4, C2 Voie alterne P, C3, B, D Amplification P, B, D Voie lectine complément

46 B) Propriétés du complément CH50 Globule rouge sensibilisé par Ac Complément Sérum patient Destruction du globule rouge

47 B) Propriétés du complément CH50 Quantification: quantité de sérum nécessaire pour lyser 50% des globules rouges Complément Sérum patient

48 B) Propriétés du complément CH50 Quelle(s) protéine(s) du complément est (sont) absente(s) ou non fonctionnelle(s)? Complément Sérum patient

49 B) Propriétés du complément C3

50 C) Réponses lymphocytaires Test de lymphoprolifération aux mitogènes Test de culture mixte (MLR)

51 C) Réponses lymphocytaires Test de lymphoprolifération aux mitogènes Les lymphocytes sont-ils capables de répondre à un mitogène non spécifique? Détection immunodéficience

52 Comment observer les réponses des lymphocytes T in vitro? Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium dans le DNA Quantité d’antigène Radioactivité

53 Prolifération lymphocytaire en présence de mitogène? Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium dans le DNA Radioactivité Mitogène

54 Analyse de la prolifération cellulaire par incorporation de thymidine marquée au tritium dans le DNA Patient immunodéficient Radioactivité Mitogène Prolifération lymphocytaire en présence de mitogène?

55 C) Réponses lymphocytaires Cultures mixtes (MLR)? Les lymphocytes d'un patient réagissent- elles contre les cellules du donneur ? Greffe

56 Prolifération lymphocytaire Radioactivité Cellules du donneur Radioactivité Pas de réaction Réaction receveur -donneur Cellules donneur (irradiées) Cellules receveur


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