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LA MÉCANIQUE DE LA DIVISION CELLULAIRE. 2 Plan I - Vue générale de la phase M II - Mitose III - Cytocinèse.

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1 LA MÉCANIQUE DE LA DIVISION CELLULAIRE

2 2 Plan I - Vue générale de la phase M II - Mitose III - Cytocinèse

3 II – Mitose

4 4 Mitose : fuseau mitotique •Émanation du cytosquelette : microtubules + protéines associées •Séparation des chromosomes filles vers les pôles •Ecartement des pôles

5 5 2 événements •Fuseau : dans le cytoplasme •Condensation des chromosomes : dans le noyau •Prométaphase : mélange des deux compartiments 

6 6 Les microtubules •Capturent les chromosomes •Intervention des moteurs –Proches des extrémités des microtubules –Famille des kinésines (  extrémité +) –Famille des dynéines (  extrémité -) •Extrémités des microtubules –Site d’assemblage et de désassemblage des microtubules –Lieu de production de force •Fuseau –Équilibre entre les deux forces opposées (moteurs + et moteurs -)

7 7 Les trois classes de microtubules –MT astraux •Irradient dans toutes les directions •Séparation des pôles –Poignées d’orientation et de positionnement du fuseau dans la cellule –MT du kinétochore •Liés au kinétochore •Fixent les chromosomes au fuseau –MT chevauchant (polaires) •Symétrie bipolaire du fuseau

8 8 Fig •Les trois classes de microtubules –MT astraux –MT du kinétochore –MT chevauchant (polaires) •Toutes les extrémités – sont vers le centrosome

9 9 Rappel sur les microtubules interphasiques •Réseau de microtubules émanant du centrosome •Instabilité dynamique •Croissance  raccourcissement = catastrophe •Raccourcissement  Croissance = restauration

10 10 Plan A.Prophase 1.Modification de la stabilité des microtubules : équilibre MAPs  catastrophines 2.Assemblage du fuseau : équilibre moteurs à direction +  moteurs à direction - B.Prométaphase C.Métaphase D.Anaphase E.Télophase

11 11 A – Prophase 1.Modification de la stabilité des microtubules : équilibre MAPs  catastrophines 2.Assemblage du fuseau : équilibre moteurs à direction +  moteurs à direction -

12 Modification de la stabilité des microtubules : équilibre MAPs  catastrophines

13 13 Changement brutal des microtubules en prophase : le constat •Longs et peu nombreux (interphase)  •Plus nombreux et plus courts •Effondrement de la demi-vie des microtubules •Augmentation de l’instabilité des microtubules •Augmentation du nombre de microtubules irradiant du centrosome –Par modification des centrosomes qui augmentent leur taux de nucléation

14 14 Fig •Les microtubules mitotiques sont différents des microtubules interphasiques

15 15 Protocole d’étude •Cellule en culture (lignée PTK1 et BSC) injectée avec tubuline- fluorochrome (dichlorotriazinyl- aminofluorescein (DTAF-tubulin)) •Irradiation avec un rayon laser d’une petite surface jusqu'à extinction de la fluorescence •Evaluation de la réapparition de la fluorescence en fonction du temps

16 16 Saxton, WM J Cell Biol 99:2175, 1984 •FIGURE 8 Comparison of FRAP rates for a metaphase and an interphase cell. Examples of relative fluorescence intensity plotted against time after photobleaching for a metaphase cell (●) and an interphase cell (○). Circles represent data points determined by microdensitometry of negatives. Lines represent best fitting curves using the function l/lmax = 1 – e –kt (30). The t ½ for each curve is noted on the X axis.

17 17 Changement brutal des microtubules en prophase : mécanisme de déclenchement en début de mitose •M-Cdk phosphoryle –Des moteurs protéiques –Des MAPs (Microtubule Associated Proteins) (leur phosphorylation  diminution de la stabilité des microtubules) •  contrôle de la dynamique des microtubules •Démonstration par biochimie chez Xenopus

18 18 Xenopus •Extrait d’œuf de Xenopus en phase M ou en interphase + •Centrosome + tubuline fluorescente  •Nucléation des microtubules à partir des centrosomes •(Analyse en vidéo microscopie à fluorescence « time-lapse ») •Mais #1p1038 –Extraits mitotiques  taux très élevé de catastrophes –Extraits interphasique  taux plus bas de catastrophes

19 19 Les catastrophines •Protéines •Augmentent la fréquence des catastrophes

20 20 Les catastrophines

21 21 Fig •Kinésines et Kinesin- related proteins –KIF2 •moteur au milieu de la chaîne lourde •pas d'activité moteur classique •se lie aux extrémités des microtubules pour augmenter leur instabilité dynamique  nom de catastrophine

22 22 Antagonisme catastrophines / MAPs

23 23 Antagonisme catastrophines / MAPs •Microtubules plus dynamiques en phase M –Par action sur catastrophines et MAPs  –Augmentation du taux de dépolymérisation des microtubules (catastrophines) –Diminution du taux de dépolymérisation des microtubules (MAPs) –Augmentation et diminution du taux de dépolymérisation des microtubules

24 24 Fig 18-12(A) Contrôle de la longueur des microtubules par l'équilibre entre catastrophines et MAPs Catastrophes avec extraits mitotiques > catastrophes avec extraits interphasiques

25 25 Fig 18-12(B) •Centrosomes et noyaux de spermatozoïdes dans des extraits mitotiques –Extraits mitotiques normaux  fuseau normal –Déplétion en XMAP215  fuseau très anormal –Probablement parce que les microtubules nucléés par les centrosomes sont trop courts Mitose dans un extrait normal Mitose dans un extrait dépléte en XMAP215

26 26 Régis Tournebize, Andrei Popov, Kazuhisa Kinoshita, Anthony J. Ashford, Sonja Rybina, Andrei Pozniakovsky, Thomas U. Mayer, Claire E. Walczak, Eric Karsenti & Anthony A. Hyman Control of microtubule dynamics by the antagonistic activities of XMAP215 and XKCM1 in Xenopus egg extracts Nature Cell Biology 2, (2000) Spindle formation observed in control and XMAP215- depleted extracts. Microtubule arrays are seen in control (left) and XMAP215- depleted (right) extracts 20 and 45 min after addition of sperm nuclei. Spindles are seen 45 min after sperm addition. Scale bar represents 10 µm. Les fuseaux deviennent visibles 45 min après l’ajout des spermatozoïdes 20 mn 45 mn

27 Assemblage du fuseau : équilibre moteurs à direction +  moteurs à direction –

28 28 Propriétés des microtubules •Si monomérique : le moteur se déplace •Si multimérique : liaison de 2 microtubules adjacents qui peuvent se déplacer l’un par rapport à l’autre –Génération de foyers à extrémités moins  pôles du fuseau –Glissement de microtubules l’un par rapport à l’autre  zone de chevauchement dans le fuseau

29 29 Fig •Importance des moteurs multimériques pour –Assemblage –fonctionnement des microtubules

30 30 Assemblage du fuseau = équilibre •Croissance de microtubules à partir de chaque centrosome  les microtubules ont des polarités opposées •Association de moteurs à déplacement +  –Écartent les centrosomes •Des moteurs à déplacement -  –Rapprochent les centrosomes •Formation du fuseau = équilibre entre les deux

31 31 Fig Prophase : séparation des pôles du fuseau grâce à •des moteurs + (kinésine): rencontre de deux microtubules polaires de polarité opposée •des moteurs – (dynéine) associés à l’enveloppe nucléaire via les microtubules astraux

32 32 Fig Prophase : séparation des pôles du fuseau grâce à •des moteurs + (kinésine): rencontre de deux microtubules polaires de polarité opposée •des moteurs – (dynéine) associés à l’enveloppe nucléaire via les microtubules astraux

33 33 Régulation de la longueur du fuseau : les moteurs du fuseau •Vertébrés : 7 familles de moteur apparentés à la kinésine •S. cerevisiae : 5 familles de moteur –Augmentation du moteur +  fuseau anormalement long –Augmentation du moteur -  fuseau anormalement court

34 34 Fig •L'influence de moteurs à sens de marche opposé sur la longueur du fuseau mitotique –Kar 3p : moteur vers - –Cin 8p : moteur vers + Chez la levure il n’y a pas de rupture de l’enveloppe nucléaire pendant la mitose Fuseau Pôles du fuseau Normal moteur -  fuseau court  moteur +  fuseau long

35 35 Chez l’homme •Probablement comme chez la levure •La phosphorylation d’au moins un moteur par M-Cdk est nécessaire pour la fixation du moteur au fuseau

36 36 B – Prométaphase •Rupture soudaine de l’enveloppe nucléaire –Déclenchée par la phosphorylation directe des lamines nucléaires par M-Cdk •Les microtubules accèdent aux chromosomes pour la 1 ère fois

37 37 Conséquences •Phénomène de « recherche et capture » des chromosomes par les microtubules •Un microtubule qui rencontre un chromosome s’attache et se stabilise  plus (zéro) de catastrophes •Peut rencontrer un kinétochore : –S’attache par l’extrémité (bout + du microtubule) –Le microtubule s’appelle alors « microtubule du kinétochore »

38 38 Fig •Les microtubules du kinétochore 1 à 40 microtubules par kinétochore ADN & les 2 kinétochores

39 39

40 40 Les kinétochores

41 41 Fig •Microscopie électronique d'un kinétochore Structure trilamellaire

42 42 Kinétochore •Rôle capital dans le mouvement des chromosomes sur le fuseau •Contiennent des moteurs + et des moteurs – •Mode d’attachement des microtubules aux kinétochores inconnu (d’autant plus que ce bout + se polymérise et se dépolymérise constamment)

43 43 Kinétochore

44 44 Microtubule Capture: A Concerted Effort Chitra Kotwaliwale and Sue Biggins Cell, Volume 127, Issue 6, 15 December 2006, Pages •Attachement du kinétochore aux microtubules et sa régulation par Aurora B •Le kinétochore – structure protéique qui se forme au contact de l’ADN centromérique-est composé de multiples protéines de liaison de faible affinité au microtubule. Alors que le complexe Ncd80 se lie à la charpente en réseau du microtubule, d’autres composants peuvent se lier à l’extrémité plus du microtubule. •En réponse à des forces de tension, Aurora B phosphoryle les protéines de liaison au microtubule pour diminuer l’affinité de ces facteurs aux microtubules. Ceci conduit au détachement des microtubules des kinétochores. Des facteurs comme INCENP- survivine peuvent exercer de nombreuses fonctions au niveau du kinétochore. En plus de leur rôle de senseurs de tension régulés par Aurora B, ces molécules peuvent aussi promouvoir une activité de liaison au noyau du microtubule

45 45 The kinetochore is a specialized chromosomal structure that facilitates chromosome attachment and movement along spindle microtubules during chromosome segregation. Furthermore, the kinetochore communicates the actual state of its interaction with the spindle to a cell cycle regulating machinery. It is the first member of a signaling cascade that inhibits sister chromatid separation (the beginning of anaphase) if chromosomes lack a stable bi-polar spindle attachment. A defect in this checkpoint function has been correlated to human cancers. My group analyses the protein composition and structure of the S. cerevisiae kinetochore by mass spectroscopy and the function of individual kinetochore proteins applying cell and molecular biological methods. Kinétochore

46 46 Kinétochore •Hierachical Structure of the Yeast Kinetochore •A small CEN DNA interacts with CBF3, an inner kinetochore complex that recruits a specialized nucleosome. Together these complexes recruit multiple discrete protein complexes, ultimately resulting in a large structure that mediates the attachment and movement of chromosomes on the mitotic spindle.

47 47 Attachement des microtubules aux kinétochores •Facile à observer dans les cellules de poumon de têtard •Liaison par le côté du microtubule •Puis glissement rapide vers le centrosome •Puis l’attachement latéral est converti en fixation par l’extrémité •En même temps attachement de l’autre kinétochore par les microtubules du centrosome opposé  •Attachement bipolaire du chromosome

48 48 Fig •Capture des microtubules par les kinétochores

49 49 Constitution de la plaque métaphasique •Les chromosomes sont tirés d’avant en arrière  •Position équidistante des pôles  •Plaque métaphasique

50 50 Fig •Plaque métaphasique : chromosomes •Kinétochores •Microtubules 5 m

51 51 Plaque métaphasique •Oscillation des chromosomes… •en attendant le signal de la séparation… •qui est le dernier signal négatif émis par le dernier kinétochore

52 52 C - Métaphase

53 53 PAUSE

54 54 Fig •Dynamique des microtubules du fuseau métaphasique –rhodamine - tubuline en rouge –colorant bleu pour l'ADN –Fluorescéine (caged) - tubuline en vert 10 m 1,5 mn 2,5 mn Fluorescéine invisible parce que « cagée » « décageage » de la fluorescéine par UV juste à gauche de la plaque métaphasique

55 55 Fig •Microscopie à fluorescence de microtubules isolés

56 56 Fig •Alignement des chromosomes sur la plaque métaphasique par des forces opposées

57 57 Fig •Assemblage du fuseau sans centrosome dans un embryon parthénogénétique d'insecte Sciara (absence d'aster)

58 58 D - Anaphase 1.Anaphase A 2.Anaphase B

59 59 Fig 18-24(A) •Assemblage d'un fuseau bipolaire sans centrosome ni kinétochore –Billes recouvertes d'ADN bactérien en présence d'extrait d'oeuf de Xenopus

60 60 Fig 18-24(B) •Assemblage d'un fuseau bipolaire sans centrosome ni kinétochore –Billes recouvertes d'ADN bactérien en présence d'extrait d'oeuf de Xenopus

61 61 Fig •Séparation des chromatides en anaphase –Microtubules colorés par des AC anti tubuline marqués à l'or

62 62 Fig 18-25A •Forces qui séparent les chromosomes en anaphase A

63 63 Fig 18-25B •Forces qui séparent les chromosomes en anaphase B

64 64 Fig •Deux modèles de migration du kinétochore vers le pôle pendant l'anaphase A

65 65 Fig •Diminution de la zone de chevauchement des microtubules chevauchant de la métaphase à l'anaphase chez les diatomés

66 66 Fig •Fonctionnement des moteurs protéiques pendant l'anaphase


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