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Introduction sur PCR, Clonage et Séquençage Sébastien Tempel UMR EcoBio 6553, Symbiose Irisa.

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1 Introduction sur PCR, Clonage et Séquençage Sébastien Tempel UMR EcoBio 6553, Symbiose Irisa

2 2 Rappels Rappels –Historique de la biologie moléculaire. –Notion de biologie. La PCR La PCR –Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les méthodes de Clonage –Les vecteurs de clonage. –Exemple d’un BAC. Le séquençage Le séquençage –Nucléotidique : méthode de Sanger. –Protéique : méthode Edman. Conclusion Conclusion

3 3 Rappels Rappels –Historique de la biologie moléculaire. –Notion de biologie. La PCR La PCR –Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les méthodes de Clonage –Les vecteurs de clonage. –Exemple d’un BAC. Le séquençage Le séquençage –Nucléotidique : méthode de Sanger. –Protéique : méthode Edman. Conclusion Conclusion

4 4 Rappels historiques F. Miescher : substance dans les noyaux : l’ADN F. Miescher : substance dans les noyaux : l’ADN G. Mendel : lois de l’hérédité G. Mendel : lois de l’hérédité T. Morgan : chromosomes portent les gènes T. Morgan : chromosomes portent les gènes W. Astbury : structure filamenteuse de l’ADN W. Astbury : structure filamenteuse de l’ADN O. Avery : lien entre l’hérédité et l’ADN O. Avery : lien entre l’hérédité et l’ADN J. Watson et F. Crick : double hélice de l’ADN J. Watson et F. Crick : double hélice de l’ADN F. Sanger : séquençage de l’insuline F. Sanger : séquençage de l’insuline J. Monod et F. Jacob : ARNm intermédiaire ADN-protéine J. Monod et F. Jacob : ARNm intermédiaire ADN-protéine

5 5 Rappels historiques M. Nirenberg, G. Khorana et R. Holley : code génétique M. Nirenberg, G. Khorana et R. Holley : code génétique 1970 : M. Temin, D. Baltimore : identification de la reverse transcriptase : M. Temin, D. Baltimore : identification de la reverse transcriptase E.M. Southern : Méthode de séquençage des nucléotides E.M. Southern : Méthode de séquençage des nucléotides W. Arber, D. Nathans, H. Smith : Identification des endonucléases W. Arber, D. Nathans, H. Smith : Identification des endonucléases : Premier génome séquencé (virus SV40 de 5kb) : Premier génome séquencé (virus SV40 de 5kb) K. Mullis : invention de la PCR K. Mullis : invention de la PCR : Premier procaryote séquencé : Haemophilus influenzae : Premier procaryote séquencé : Haemophilus influenzae. 15 avril 2003 : Séquençage génome humain terminé. 15 avril 2003 : Séquençage génome humain terminé.

6 6 Rappels Rappels –Historique de la biologie moléculaire. –Notion de biologie. La PCR La PCR –Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les méthodes de Clonage –Les vecteurs de clonage. –Exemple d’un BAC. Le séquençage Le séquençage –Nucléotidique : méthode de Sanger. –Protéique : méthode Edman. Conclusion Conclusion

7 7 Notion de biologie virus, cellules, organelles

8 8

9 9

10 10 Notion de biologie virus, cellules, organelles

11 11 Notion de biologie virus, cellules, organelles

12 12 Notion de biologie ADN et ARN ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADN : Acide DésoxyriboNucléique Rôle de l’ADN : pérenniser de génération en génération les informations de l’organisme. Rôle de l’ADN : pérenniser de génération en génération les informations de l’organisme. Localisation de l’ADN : Localisation de l’ADN : –Virus à ADN : intérieur de la capside –Procaryote : chromosome circulaire, plasmide –Eucaryote :  Cellule végétale : chromosome, mitochondrie, chloroplaste …  Cellule animale : chromosome, mitochondrie …

13 13 Notion de biologie ADN et ARN

14 14 Notion de biologie ADN et ARN

15 15 Notion de biologie ADN et ARN ARN : Acide RiboNucléique ARN : Acide RiboNucléique Rôles de l’ARN : même que celui de l’ADN dans les virus à ARN, intermédiaire entre l’information portée par l’ADN et son expression par les protéines … Rôles de l’ARN : même que celui de l’ADN dans les virus à ARN, intermédiaire entre l’information portée par l’ADN et son expression par les protéines … Localisation de l’ARN : Localisation de l’ARN : –ARNm présent partout dans les cellules eucaryotes et procaryotes. –ARNr et ARNt présents dans les organelles où est localisé l’ADN.

16 16 Notion de biologie ADN et ARN

17 17 Notion de biologie Acide Aminé

18 18 Notion de biologie Protéine Structure primaire : séquence d’acide aminé. Structure primaire : séquence d’acide aminé. Structure secondaire : hélice alpha, feuillet bêta, pont disulfure. Structure secondaire : hélice alpha, feuillet bêta, pont disulfure. Structure tertiaire : suite de structure primaire et secondaire. Structure tertiaire : suite de structure primaire et secondaire. Structure quaternaire : association de structure tertiaire Structure quaternaire : association de structure tertiaire –Ex : tétramère d’hémoglobine, insuline...

19 19 Notion de biologie Protéine

20 20 Notion de biologie Protéine

21 21 Notion de biologie Protéine

22 22 Notion de biologie Protéine

23 23 Notion de biologie

24 24 Rappels Rappels –Historique de la biologie moléculaire. –Notion de biologie. La PCR La PCR –Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les méthodes de Clonage –Les vecteurs de clonage. –Exemple d’un BAC. Le séquençage Le séquençage –Nucléotidique : méthode de Sanger. –Protéique : méthode Edman. Conclusion Conclusion

25 25 PCR Polymerase Chain Reaction But de la PCR : But de la PCR : –Amplification d’ADN. –Base pour différentes techniques de biologie moléculaire :  Séquençage  Amplification de l’ADN pour le clonage  mutation ponctuelle  « differential display »  préparation d’ADNc « RT-PCR »  détermination de polymorphisme entre génomes (RFLP…)  ….

26 26

27 27 Rappels Rappels –Historique de la biologie moléculaire. –Notion de biologie. La PCR La PCR –Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les méthodes de Clonage –Les vecteurs de clonage. –Exemple d’un BAC. Le séquençage Le séquençage –Nucléotidique : méthode de Sanger. –Protéique : méthode Edman. Conclusion Conclusion

28 28 Clonage de séquences Vecteur de clonage : Vecteur de clonage : –Plasmide bactérien ( 3-4 kb ) –Phage λ ( 9-22 kb ) –Cosmide ( ≈ 45 kb ) –PAC : P1-derived Artificial Chromosome ( kb ) –BAC : Bacterial Artificial Chromosome ( kb ) –YAC : Yeast Artificial Chromosome ( kb )

29 29 Rappels Rappels –Historique de la biologie moléculaire. –Notion de biologie. La PCR La PCR –Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les méthodes de Clonage –Les vecteurs de clonage. –Exemple d’un BAC. Le séquençage Le séquençage –Nucléotidique : méthode de Sanger. –Protéique : méthode Edman. Conclusion Conclusion

30 30 Clonage de séquences Structure du BAC : Structure du BAC : –oriS : origine de réplication –repE : maintient du nombre de plasmide à 1 ou 2 par cellule. –parA, parB : stabilité du plasmide, incompatibilité avec les autres facteurs F. –CM R : gène de résistance au chloramphénicol.

31 31 Clonage de séquences Structure du BAC : Structure du BAC : –Site de clonage dans le gène LacZ. –T7 et SP6 : promoteurs forts de bactériophage. –NotI, HindIII, BamHI : site de reconnaissance des endonucléases.

32 32 Clonage de séquences Digestion du vecteur et de l’ADN à cloner par HindIII. Digestion du vecteur et de l’ADN à cloner par HindIII. Sélection de l’ADN >150kb par électrophorèse. Sélection de l’ADN >150kb par électrophorèse.

33 33 Clonage de séquences Transformation de E.coli par électroporation : Transformation de E.coli par électroporation : –Les bactéries à transformer doivent être en phase exponentielle de croissance. –Le courant traverse les membranes des E.coli formant des pores sur les membranes. –Les macromolécules chargées (comme les vecteurs) pénètrent par les pores des bactéries. –L’intensité et la durée du champ électrique doivent être précises:  Si trop faible les pores seront trop petits pour laisser entrer les vecteurs.  Si trop fort, les pores ne pourront pas se refermer tuant ainsi la cellule.

34 34 Clonage de séquences Étalement des colonies sur un milieu contenant du chloramphénicol, de IPTG et de l’X-Gal. Étalement des colonies sur un milieu contenant du chloramphénicol, de IPTG et de l’X-Gal. –IPTG (isopropylthio-beta-D-galactoside) : sucre induisant la transcription du gène LacZ. –X-Gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactoside) : sucre donnant une coloration bleue s’il est utilisé (dégradé) par LacZ. Bactérie avec le plasmide (BAC) donnera des colonies : Bactérie avec le plasmide (BAC) donnera des colonies : –Couleur bleue si le plasmide ne contient pas d’ADN recombinant. –Couleur blanche si le plasmide en contient.

35 35 Clonage de séquences

36 36 Clonage de séquences

37 37 Rappels Rappels –Historique de la biologie moléculaire. –Notion de biologie. La PCR La PCR –Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les méthodes de Clonage –Les vecteurs de clonage. –Exemple d’un BAC. Le séquençage Le séquençage –Nucléotidique : méthode de Sanger. –Protéique : méthode Edman. Conclusion Conclusion

38 38 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger ddNTP : analogues structuraux des dNTP. ddNTP : analogues structuraux des dNTP. ddNTP : incapables de réaliser une liaison phosphodiester. ddNTP : incapables de réaliser une liaison phosphodiester. ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP. ADN polymérase incorpore dNTP ou ddNTP.

39 39 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger

40 40 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer. Liaison de l’amorce avec l’ADN à séquencer. La fixation des ddNTP aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles. La fixation des ddNTP aux brins d’ADN va créer des brins de différentes tailles. Les brins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite. Les brins vont migrer sur un gel d’électrophorèse selon leur taille : le plus petit migre le plus vite.

41 41 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger

42 42 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger Automatisation de la méthode : Automatisation de la méthode : –Ajout sur les ddNTP de fluorochrome de différentes couleurs. –1 seul tube regroupant les ddNTP. –Lecture par un laser des fragments qui migrent sur le gel. –Stockage des données dans la mémoire de l’ordinateur.

43 43 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger

44 44 Séquençage nucléotide : méthode de Sanger

45 45 Rappels Rappels –Historique de la biologie moléculaire. –Notion de biologie. La PCR La PCR –Ses buts, sa technique. Les méthodes de Clonage Les méthodes de Clonage –Les vecteurs de clonage. –Exemple d’un BAC. Le séquençage Le séquençage –Nucléotidique : méthode de Sanger. –Protéique : méthode Edman. Conclusion Conclusion

46 46 Séquençage protéique Si on possède l’ARNm : Si on possède l’ARNm : –Réalisation d’une RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) :  Transformation de l’ARNm en ADNc par la reverse transcriptase.  PCR classique sur l’ADNc. –Séquençage des nucléotides amplifiés par méthode de Sanger Si on ne possède que la protéine : Si on ne possède que la protéine : –Purification de la protéine par méthode de chromatographie –Méthode d’Edman.

47 47 Séquençage protéique : méthode d’Edman

48 48 Rappels Rappels –Historique de la biologie moléculaire. –Notion de biologie. La PCR La PCR –Ses buts, sa technique Les méthodes de Clonage Les méthodes de Clonage –Les vecteurs de clonage. –Exemple d’un BAC. Le séquençage Le séquençage –Nucléotidique : méthode de Sanger. –Protéique : méthode Edman. Conclusion Conclusion

49 49 Conclusion


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