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| 1 Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014 Adjuvants et Formulations vaccinales.

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1 | 1 Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014 Adjuvants et Formulations vaccinales

2 | 2 Towards tailored vaccine delivery: Needs, challenges and perspectives. J.-P. Amorij et al. / Journal of Controlled Release 161 (2012) 363–376 Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

3 | 3 Nature de l’antigène. Bridging the knowledge gaps in vaccine design, Rino Rappuoli;Nature Biotechnology 25, (2007) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

4 | 4 Vaccins atténués (Vaccins vivants) Vaccins inactivés (tués) Polysaccharides +/- conjugués (vaccins conjugués) Protéines purifiées à partir de virus ou de bactéries (vaccins sous unitaires) Protéines recombinantes (vaccins synthétiques) Besoin en adjuvant Degré de pureté Pourquoi un adjuvant ? Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

5 | 5 Nécessité d’un adjuvant ● La simplification des vaccins et la purification des antigènes suppriment le signal immunostimulant présent naturellement dans les virus et les bactéries atténués et inactivés. ● Antigènes recombinants ● Adjuvants «synthétiques» ● Cette immunostimulation est nécessaire pour rendre le vaccin efficace ● Amplifier la réponse immune ● Limiter la dose d’antigène nécessaire au vaccin ● Maintien de la réponse immunitaire dans le temps (mémoire) ● Modulation de la réponse immunitaire (Th1, Th2, CTL…) ● Adapter le vaccin aux faibles répondeurs ● Evolutions de la vaccination ● Adapter la vaccination à l’Allongement de la durée de vie ● Combattre les infections chroniques et les cancers ● Orientation cellulaire de la réponse immune ● Nouvelles voies d’immunisation Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

6 | 6 Diversité moléculaire des adjuvants Vaxjo: A Web-Based Vaccine Adjuvant Database and Its Application for Analysis of Vaccine Adjuvants and Their Uses in Vaccine Development. Sayers et al Journal of Biomedicine and Biotechnology, adjuvants in the database. Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

7 Adjuvants de vaccins le 21 février 2013,FDa. | 7 Adjuvants vaccinaux approuvés chez l’homme : Nathalie Garçon, Geert Leroux-Roels, Wen-Fang Cheng, Understanding Modern Vaccines : Perspectives in Vaccinology, 2011 Elsevier B.V.

8 | 8 Sels d’Aluminium Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

9 Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 avril 2013 | 9 Vaccins de Sanofi Pasteur utilisant des sels d’aluminium : ● Avaxim (hépatite A inactivé) ● Diftavax, DT Vax (diphtérie et tétanos) ● DTP, DT, Imovax DT, TD adsorbé et DPT adsorbé ● Tetanus toxoid adsorbed (tétanos) ● Tetavax (tétanos) ● DT Coq (diphtérie, tétanos et coqueluche) ● Genhevac B Pasteur (hépatite B inactivé) ● Imovax DPT polio et Tetracoq (diphtérie, tétanos, coqueluche et polio inactivé) ● PENTAct-HiB (Haemophilus influenzae type b, diphterie, tétanos, coqueluche et polio inactivé) ● ProHIBiT-DPT, Tripacel (Haemophilus influenzae, anatoxines diphtérique et tétaniques adsorbées) ● HEXAXIM (diphtérie, tétanos, coqueluche, polio, Haemophilus influenzae type b et hépatite B).

10 | 10 Les sels d’aluminium ● Mécanismes d’action et limitations ● Effet dépôt: libération lente de l’antigène (?) ● Inflammation au site d’injection et recrutement d’APC ● Particules adsorbant l’antigène captées par les macrophages (activation, induction d’IL-1) et les DC ● Action via le récepteur cytosolique NALP3 (NLR) action sur les caspases et la sécretion d’IL1 ● Activation du système du complément et des éosinophiles ● Effet sur la réponse humorale uniquement et polarisation vers la voie Th2 [IL-4, IgE, IgG1 (souris) IgG4 (homme)] ● Mais ● pas de lyophilisation ou congélation possibles ● aucun effet sur la réponse à médiation cellulaire T CD8+ Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

11 | 11 Mécanisme d’action Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

12 | 12 Mécanisme d’action ● Association avec l’antigène (adsorption) ● Effet antigène dépendant ● Effet dépôt ● Théorie initiale d’une lente libération de l’antigène au site d’injection ● Pas d’évidences sur la nécessité de cet effet dépôt ● Effet dépôt n’est pas nécessaire ● Mécanisme d’action loin d’être définitivement établi ● Activation des macrophages et des éosinophiles ● Interaction avec les cellules dendritiques ● Inflammasome Novel cellular and molecular mechanisms of induction of immune responses by aluminum adjuvants V. Aimanianda, J.Haensler, S. Lacroix-Desmazes,S.V. Kaveri,J. Bayry. Trends in Pharmacological science Volume 30, Issue 6, June 2009, Pages 287–295Volume 30, Issue 6 Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

13 | 13 Les sels d’aluminium - Exemple Anti-Ag IgG1titers post second injection (Day 35) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

14 | 14 Liposomes Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

15 | 15 Les liposomes-Généralités Vésicules artificielles: bicouche de phospholipides en solution aqueuse (1965, Bangham et al.) Inclusions d’antigènes (hydrophiles ou hydrophobes) dans les liposomes Insertion de molécules de ciblage (peptides fusogènes, récepteurs, ligands)  stabilité,  relargage aux APCs (Allisson et Gregoriadis, 1974) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

16 | 16 Liposomes : Virosomes® Berna, Nasal Flu Rinaldo Zurbriggen Vaccine( 2003) 21: Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

17 | 17 ● Avantages: beaucoup de formes dérivées des liposomes sont possibles: ● addition de molécules adjuvantes (cytokines, MPL, ISS…) ● modifications pour améliorer le ciblage (Virosomes: sendai, Influenza: IRIV) ● Liposomes cationiques ● Comparison of the depot effect and immunogenicity of liposomes based on DDA, DC-Chol and DOTAP: Prolonged liposome retention mediates stronger Th1 responses. Henriksen-Lacey M, Christensen D, Bramwell VW, Lindenstrøm T, Agger EM, Andersen P, Perrie Y. Mol Pharm Nov 30. Les liposomes Utilisation vaccinale, suite Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

18 | 18 CAF01 ● The CAF01 adjuvant enhances antigen uptake and presentation. ● When a vaccine antigen is formulated with the CAF01 adjuvant, antigen presenting cells readily acquire the antigen, leading to enhanced antigen presentation. ● This efficiently promote antigen-specific T lymphocytes and long- term immunological memory. dimethyldioctadecylammonium (DDA) and trehalose dibehenate (TDB), Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

19 | 19 ISCOMS (1) CSL ● Immunostimulating complex ● Structure développée pour la présentation de protéine membranaires provenant de virus enveloppés avec des possibilités d’immunomodulation Activité adjuvante détectée en 1951 par Espinet Morein B. Et al. Nature 308 (1984) 457. Saponin provenant de l’écorce de the Quillaja saponaria Quil A QS 21 Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

20 | 20 ISCOMs® and ISCOMATRIX® adjuvants ● ISCOMs® are 40 nm large particles made up of saponins (Quil A), lipids, cholesterol and antigen ● Delivery systems with increased efficiency of antigen presentation to B cells and uptake by the APC ● The ISCOMATRIX® adjuvant is identical to ISCOMs® except that it does not contain antigen ● The ISCOMATRIX® induced a Th2-like response, whereas the ISCOMs®-based vaccine induced a mixed Th1/Th2 response ● 3rd generation ISCOM™ adjuvant Matrix M adjuvant (Isconova, Sweden; Crucell) consists of 2 saponin fractions from quillaja ● Study of a Parenterally Administered H5N1 Influenza Vaccine in Healthy Adults (PANFLUVAC) ClinicalTrials (gov Identifier:NCT ) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

21 Schematic of how ISCOMATRIX adjuvant may facilitate Ag translocation Adjuvants de vaccins le 21 février 2013,FDa. | 21 Development of prophylactic and therapeutic vaccines using the ISCOMATRIX adjuvant. E. Maraskovsky, M. Schnurr, N.S. Wilson, N. C. Robson, J.Boyle and D. Drane, Immunology and Cell Biology (2009) 87, 371–376

22 ISCOMATRIX | 22 ISCOMATRIX adjuvant induces antigen translocation from endosomes and lysosomes to the cytosol in dendritic cells (DCs). MoDCs were incubated with soluble OVA-Alexa-488 alone or OVAAlexa488/ISCOMATRIX (green Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

23 | 23 Emulsions Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

24 | 24 Les Emulsions Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

25 | 25 Emulsions, effet dépôt, signal de danger. ● Syntex adjuvant formulation (SAF) –Roche Squalane MDP-peptidoglycan Pluronic L-121, polysorbate 80 (Tween 80) ● Chiron MF 59 Squalène, Span 85, Tween 80 MTP-PE, MDPsynthétique lipidé From: Methods in Molecular Medicine, Vol. 42: Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols Edited by: D. T. O’Hagan © Humana Press, Inc., Totowa, NJ ● Adjuvant de Freund Huile minérale 85%, Arlacel A (manide monooléate)phase aqueuse contenant 500µl/ml Mycobacterium tuberculosis Freund,J. 1956, The mode of action of immunologic adjuvants, Adv Tuberc Res 7: Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

26 | 26 Composition of MF59 D. O’Hagan et al., Expert Rev. Vaccines 12(1), (2013) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

27 Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 avril 2013 | 27 A. Seubert et al.The Journal of Immunology, 2008, 180:

28 | 28 Caractéristiques du MF59 ● Augmentation des titres anticorps, des proliférations de cellules T CD4, des activités CTL dans certains modèles antigéniques chez la souris ● Augmentation du relargage de chemokines par les macrophages ● Augmentation de l’uptake des Ag par les monocytes. Differencient et migrent ● Maturation des DCs et up-regulation du CCR7, et des DC homing receptor pour les ganglions drainants ● MF59 est en clinique avec d’autres antigènes (HCV, papilloma, glycoconjugués, peptides…) Anja Seubert, Elisabetta Monaci, Mariagrazia Pizza, Derek T. O’Hagan and Andreas Wack2.The Adjuvants Aluminum Hydroxide and MF59 Induce Monocyte and Granulocyte Chemoattractants and Enhance Monocyte Differentiation toward Dendritic Cells The Journal of Immunology, 2008, 180: Novartis Vaccines, Siena, Italy2 Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

29 | 29 Composition of clinical O/W adjuvant formulations NameCompanyComponentsv/v % oil component Particle Size (nm) Manufacturing Process Adm. Route Clinical Phase MF59NovartisSqualene, polysorbate 80, sorbitan trioleate, citrate buffer MicrofluidizationIMLicensed AS03GSK Squalene,  -tocopherol, polysorbate 80, PBS MicrofluidizationIMLicensed AS02GSKAS03 plus MPL and QS215MicrofluidizationIMPhase III AF03SanofiSqualene, polyoxyethylene cetyl-stearylether, sorbitan oleate, PBS, mannitol PITIMPhase III SE,MPL- SE,GLA- SE IDRI/IDCSqualene, phosphatidylcholine, poloxamer 188, glycerol, ammoniumphosphate buffer, MPL or GLA may be incorporated 2120MicrofluidizationIMPhase I/II CoVaccine HT BTGSqualene, polysorbate 80, PBS, sucrose fatty acid sulfate esters MicrofluidizationIMPhase I W805ECNanoBioSoybean oil, polysorbate 80, cethylpyridinium chloride, PBS, ethanol High Speed Emulsification INPhase I Adapted from Cox C. and Haensler Expert Rev Vaccines Jul;12(7): Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

30 | 30 Adjuvants: cibler et activer spécifiquement les récepteurs de l’immunité innée Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014 Toll mutants are highly susceptible to fungal infection (Lemaître et al., 1996)

31 | 31 Recepteurs Toll chez les mammifères. ● PAMP: pathogen-associated molecular pattern Streptococcus pneumoniae Staphyllococcus auréus Escherichia coli Virus de la grippe Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

32 | 32 Les immunomodulateurs et immunostimulants ● Adjuvants Th1 (par exemple, agonistes de TLR4, TL3, TLR7/8 et TLR9) ● In vivo chez la souris Potentialise la réponse humorale avec IgG2a>>IgG1 (favorise l’induction d’anticorps fixant le complément) Augmente la réponse CD4 et oriente la réponse vers Th1 (IFN-g>IL-5) Induit des CTL si présentation Classe 1: R848 et CpG>MPL ● In vitro sur cellules humaines Induit des cytokines pro-inflammatoires IL-6, TNFa Induit des cytokines pro-Th1 (IL12p70) Provoque la maturation des cellules dendritiques Attention: chez l’homme: pas de lien Th1 et isotypes d’Ac Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

33 Pertussis & adjuvants Oct 2013 | 33 Towards registration… ● Additionally to the first VRBPAC on HEPLISAV on November 2012, where an additional safety study would be required by FDA before the agency would consider approving the hepatitis B vaccine, Dynavax reported the design of its next large-scale clinical study for its lead drug HEPLISAV. ● The planned study, HBV-23, is intended to provide a sufficiently sized safety database for the Agency to complete its review of Dynavax's Biologics License Application (BLA)”. ● It will be an 8,000 subject, Phase 3 ● HEPLISAV compared with Engerix-B in adults 18 to 70 years of age ● 5,500 will be treated with HEPLISAV ● 2,500 will be treated with GlaxoSmithKline's (GSK) Engerix-B,GSK ● Two doses HEPLISAV at 0 and 1 month

34 | 34 IC31 Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

35 | 35 (a)Imiquimod (b)Resiquimod (c)Loxoribine or 7-allyl-8-oxoguanosine is a guanine nucleoside analog; (d) bromopirimine or 2-amino-5-bromo-6- phenyl-4(3)-pyrimidinone has a structure reminiscent of pyrimidines Adjuvants Th1: agonistes de TLR7/8 (1) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

36 | 36 Agonistes TLR7 et TLR8 = TLA7/8M Ag DC-Chol DPPC TLA7/8M Adjuvants Th1: agonistes de TLR7/8 (2) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

37 | 37 ● Agonistes TLR9: séquences immunostimulantes ISS=ODN= CpG ● Découverte des ISS: 1- plasmide ADN efficace, 2- ACF + DNAse inactif  Effet adjuvant de l’ADN bactérien ● Criblage de 45-mer oligonucléotides (ODN) pour l’induction d’IFN-g motifs CpG: 5’-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-3’ (5’-AGCGCT- 3’) (fréquence des CpG: 1/16 de l’ADN des procaryotes vs 1/50 de l’ADN des eucaryotes) ● Effets de l’ADN bactérien (ADN vertébrés: inactif): cytosines non- méthylées: CpG non-méthylés ● Effets de l’ADN bactérien ou d’ODN synthétiques non-méthylés sur l’activation des cellules du sytème immunitaire ou sur une application vaccinale: > 448 articles depuis 1997 ● Plusieurs approches en compétition: CpG, ISS, IMO, etc… ● Question majeure – possibilité d’induction d’autoimmunité (Krieg et al; Nat Immunol. 2002, 3:423) Adjuvants Th1: agonistes de TLR9 (1) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

38 | 38 Adjuvants Th1: agonistes de TLR4 (1) ● Monophosphoryl Lipid A (MPL) ● LPS: adjuvant: Johnson, Détoxification par hydrolyse acide: Ribi, 1979 ● MPL: LPS détoxifié purifié à partir de bactéries Gram- (Salmonella minnesota ou E coli) ● Interagit avec TLR4 sur les APC et induit la production de NO, cytokines pro-inflammatoires (IL-1, IL-6, TNF-a) et lymphokines T (IL-2, IFN-g) ● Formulation du MPL (GSK): phase aqueuse, émulsion (AS02), adsorbé sur Alum (AS04), liposomes... ● Stabilité et innocuité satisfaisantes: essais cliniques >270,000 doses ● FendrixTM (HBV) et CervarixTM (HPV) commercialisés ● Dérivés synthétiques par Ribi/Corixa/GSK (RC-529): Etudes structure/fonction sur ces molécules; avantage pour le manufacturing Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

39 Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 avril 2013 | 39 Voies de signalisation des TLRs L’association d’agonistes de TLRs ayant des voies de signalisation différente peut avoir des effets synergiques

40 | 40 AS04 monophosphoryl lipid A (MPL) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

41 | 41 Mode d’action de AS04 ● Cervarix ® et Fendrix ® ● Colocalisation sur une fenêtre de temps de 24 heures. ● Activation des monocytes et des DC migration vers les ganglions drainants. ● Effet limité aux cellules qui expriment le TLR4 ● Dendritiques ● Monocytes ● Cervarix ® 13,9 million de dose. The safety evaluation of adjuvants during vaccine development: The AS04 experience. Garçon N. et al. Vaccine 29 (2011) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

42 | 42 Effet d’un immunomodulateur Adjuvant related antibody titers Adj 3 MF Ag Ag + Emulsion - TLA Negative control Reciprocal Titer Ag + TLA Ag + Emulsion Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

43 | 43 Les adjuvants Retour en arrière: Définitions et contraintes ● Les adjuvants: molécules qui incorporées dans les préparations vaccinales permettent d'augmenter l’intensité et la durée de la réponse immunitaire spécifique aux antigènes vaccinaux et/ou d’en influencer la nature (Th1/Th2, humorale versus cellulaire) ● Un bon adjuvant doit : Stimuler une forte réponse humorale et/ou cellulaire Induire une mémoire immunitaire Être non-toxique aux doses efficaces utilisées Être non-mutagène, carcinogène ou tératogène Être non-pyrogène Ne pas induire d’auto-immunité Être stable (temps, température, pH) Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

44 | 44 ● voie orale ● Voie mucosale ● Voie cutanée Adjuvants pour autres voies d’administration Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

45 | 45 Adjuvants: Conclusions (1) ● Mécanismes d’action commencent à être étudiés ● Meilleure connaissance des mécanismes d’immunologie fondamentale ● Le couple antigène-adjuvant est déterminant: pas d’adjuvant universel ● L’activité adjuvante est souvent liée à une réactivité ● Autorisation de mise sur le marché (AMM) de plus en plus réglementée Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

46 | 46 Safety evaluation of adjuvants ● European Medicines Agency: Committee for proprietary medicinal products (CPMP). Note for guidance on preclinical pharmacological and toxicological testing of vaccines; Report no.: CPMP/SWP/465/95. Available from: ● ● Food and Drug Administration (FDA): Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Guidance for Industry for the Evaluation of Combination Vaccines for Preventable Diseases: Production, Testing and Clinical Studies; Available from: tion/Guidances/Vaccines/UCM pdf. tion/Guidances/Vaccines/UCM pdf ● World Health Organisation. WHO guidelines on nonclinical evaluation of vaccines; Available from: ● European Medicines Agency: Committee for medicinal products for human use (CHMP). Guideline on adjuvants in vaccines for human use; Report no.: EMEA/CHMP/VEG/ Available from: ● Food and Drug Administration: Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Guidance for Industry: Considerations for Developmental Toxicity Studies for Preventive and Therapeutic Vaccines for Infectious Disease Indications; Available from: tion/Guidances/Vaccines/ucm pdf. tion/Guidances/Vaccines/ucm pdf Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014

47 | 47 Adjuvants: Conclusions (2) ● Peu d’adjuvants sont utilisés chez l’homme: essentiellement sels d’aluminium et les émulsions de squalène ● TLR agonistes prennent place ● De nouveaux adjuvants sont indispensables pour développer de nouveaux vaccins, en particulier contre les cancers et les infections virales pour lesquels une réponse Th1 et/ou CTL est indispensable ● Longue liste d’adjuvants actuellement en essais cliniques (MPL, émulsions, ISCOM, QS21, liposomes, autres agonistes de TLR...) ● La balance efficacité/risque est critique pour la sélection d’un adjuvant ● Modèles animaux insuffisamment prédictifs: necessité d’essais cliniques Adjuvants et Formulations vaccinales le 18 mars 2014


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