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Titre de l’atelier : Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires Intervenant(s) : Lauranne Paillard; Virginie Goubert.

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1 Titre de l’atelier : Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires Intervenant(s) : Lauranne Paillard; Virginie Goubert

2 Atelier protéomique fonctionnelle : Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires

3 Partie 1 Présentation de la plate forme Lauranne Paillard-Laurance Ingénieure Partie 2 Présentation des technologies Alpha et Label free Virginie Goubert Drug discovery application specialist Partie 3 Applications et exemples réalisés sur la plate forme Lauranne Paillard-Laurance Ingénieure Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires

4 Interactions Moléculaires Puces ACTivités L. Paillard-Laurance Gen2Bio 3 avril 2014 Saint-Malo

5 Mer Agro Santé Bio-informatique Le réseau Biogenouest 4 domaines d'activité 29 plates-formes technologiques Plus de 70 unités de recherche 6 axes technologiques : Génomique Protéomique Exploration fonctionnelle Bio-imagerie Analyse structurale et métabolomique Bio-informatique

6 Nantes Rennes Axe Protéomique Animateur : Charles Pineau & P. Weigel Identification–Caractérisation à haut débit Charles Pineau Interactions moléculaires puces activités (IMPACT) Yannick Jacques et Pierre Weigel

7 Caractérisation des PROTEines exprimées par un génOME dans un système biologique déterminé. Cartographie et identification des protéines Trois domaines: Structure / Fonctions Analyse des interactions / recherche de partenaires Etude des protéines à grande échelle par des méthodes de biochimie et de biologie structurale en relation avec les données du génome Protéomique

8 Etude de l’ensemble des interactions entre les protéines d’un organisme Objectifs  Connaître la liste des gènes et des protéines d’un organisme  Savoir comment ces éléments interagissent En pratique  Déterminer quelles protéines interagissent avec quelles autres  Dans un milieu dynamique (cellule vivante) Innombrables réactions chimiques à chaque seconde Solutions 1. Etudier le contenu (cartographie) 2. Etudier les interactions dans leur contexte cellulaire naturel 3. Etudier dans le détail chaque interaction Dans un système biologique donné Interactomique

9 1. Activité de services 1. Aide méthodologique 2. Projets collaboratifs 2. Activité de R&D 3. Activité de formation 50 % de projets en interne 50% de projets externes Démarche qualité – certification Iso 9001 à court terme Les 3 activités de la plateforme Impact

10 Pourquoi venir sur la plate forme Impact ?

11  Expertise :  Profiling de l’expression protéique  Criblage d’activités biologiques  Caractérisation / Validation des interactions  Applications dans les domaines de la santé et des biotechnologies Activité niche en protéomique fonctionnelle

12 ExpertiseTechnologies Profiling Etude du profil d’expression de protéines Analyse de la modulation des modifications post-traductionnelles de protéines : phosphorylation, ubiquitination, SUMOylation glycosylation… Puces à protéines SPR imaging Criblage Criblage modèle dédiés à l’étude de la fonctionnalité de récepteurs membranaires Criblage de chimiothèques sur la base de modèles SPR BRET FRET Label free, Alpha Caractérisation Validation Validation de l’interaction protéine/ligand Détermination de l’affinité Etude des paramètres thermodynamiques SPR iTC Label free Fluorescence Contrôle qualité Analyse de l'intégrité structurale ou de la fonctionnalité Evaluation de la pureté de protéines Bioanalyzer Dichroisme circulaire iTC

13 Puces à protéines sciFLEXARRAYER S3 (Scienion) SPRiplex II Biacore 2000 / 3000 Dichroïsme Circulaire et linéaire Spectropolarimètre J-810 Fluorescence/anisotropie fluorescence Spectrofluorimètre FP-6500 Photomètre de polarisation de fluorescence FP-715 HTRF / BRET / FRET / AF Mithras LB940 Microcalorimètre Auto iTC200 Technologies Alpha et Label Free EnSpire Equipements de la plate forme Impact

14 Technologies Alpha ® et Label Free Sur l’EnSpire Equipements de la plate forme Impact

15  Alpha Technology 15

16 Bead-based - Donor and Acceptor Beads Homogeneous - no wash steps Versatility - Detects virtually any molecule from large endogenous protein complexes to very small peptides Works in a variety of sample types including serum, plasma, cell lysates and cell supernatant High sensitivity (fmol) - Amplified signal Low background - Emission wavelength is lower than Excitation Alpha ® : Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay

17 Donor Beads  Unconjugated  Ni 2+ chelate  Glutathione (GSH)  Protein A  Anti-FLAG  Anti-mouse IgG  Anti-Rabbit IgG  Strep-Tactin Optimization kits  TruHits  Omnibeads AlphaLISA Acceptor Beads  Protein A  Protein G  Protein L  Anti-human IgG  Anti-rabbit IgG  Anti-mouse IgG  Anti-mouse IgM  Anti-rat IgG  Anti-goat IgG  Anti-sheep IgG  Anti-chicken IgY  Streptavidin  Nickel chelate  Glutathione (GSH)  Anti-FLAG  Anti-GST  Anti-c-myc  Anti-DIG  Anti-FITC  Anti-V5  Anti-GFP  Anti-MBP  Strep-Tactin Alpha Toolbox for Assay Development

18  >120 Biomarker kits (immunoassays – ELISA conversion)  86 SureFire kits for protein phosphorylation  >20 reagents to measure the activity of epigenetic enzymes  > 10 kits for cell-based epigenetics assays  cAMP, cGMP determination  Biotherapeutics analysis: PK, PD, ADA assays (immunoassays), clone screening, isotyping, functional testing, Host- cell contaminants, …  Toolbox: Even more flexibility to develop:  Other biomarkers, all the above but as custom kits,...  Protein-protein interactions, Protein-DNA interaction, Protein-RNA interaction, Protein-small molecule interaction, Cellular markers or signaling, Biochemical Binding Assays…..ie. Receptor + Ligand/Mab Virtually any assay can be developed, as long as you can bring the beads together Alpha: A broad assay platform Homogeneous assays:  Few steps, faster data generation  Improved CV compared to wash assays  Reduced consumption of sample  Compatible with multiple types of samples

19 19 Low affinity protein-protein interaction:p53/hDM2 (µM range) Non Specific Total [GST-HDM2] (nM) AlphaScreen Signal (cps) [GST-HDM2] (nM)IC 50 (  M) log [p53 peptide] (M) AlphaScreen Signal (cps) anti GST p53 peptide

20 20 Cellular assay for measuring p65-IkBa interaction

21 21 ELISA AlphaLISA AlphaLISA comparison to ELISA How does AlphaLISA compare to traditional ELISA?  AlphaLISA is bead based, technically different…but similar in functionality (sandwich assay in solution)  No wash vs wash (time consuming)  Scalable (from 96-well to 1536-well)  Very wide dynamic range 2-incubation step protocol for most assays: Just 4 steps to results  Add standard or sample  Add mix: biotinylated Ab & acc beads 60 min incubation  Add donor beads 60 min incubation  Read

22 22 Alpha Molecular Weight Range for Targets  AlphaLISA can cover a wide range of sizes:  - Giant particles (100MDa+) ex. M13 phages  - Huge proteo-glycans (1MDa+) ex. chondroitine  - Large proteins (150kDa+) ex. hIgG  - Medium protein (50kDa+) ex. trimeric TNF   - Small protein (5kDa+) ex. insulin  - Large peptides (30aa+) ex. Aß42  - Small peptides (5-30aa) ex. Angiotensin I  - Small molecules ex. cAMP

23 23  Homogeneous Cell-based assay  Highly sensitive: Over-expressed and endogenous receptors  Receptor-mediated signaling modulation: GPCRs, Receptors Tyr Kinases, Cytokine Receptors, Inflammatory responses  Intracellular kinase signaling cascade modulation: monitor a single target or multiple targets  Use in many different cell lines, incl. Primary Cells Detection of phospho-Kinases in Cell lysates with SureFire kits

24 24 Measurement of ERK phosphorylation in Swiss 3T3 cells % Activation Log [Bombesin] (M) [Bombesin] Western blot pERK1/2 10 µM 40 pM AlphaScreen ® SureFire ™ Cellular ERK assay Stimulation of Endogenous Bombesin Receptors GPCR Activation

25  Label-Free Technology 25

26 26 PKI + Epic = EnSpire Label-Free EnSpire ® Multimode Reader + Epic ® Generation 2 Label-free Reader = The First Multimode Bench-top Instrument With Label-free Capability For Both Cell-based & Biochemical Assays!

27 27 High Quality Label-free Microplates Incorporate Patented Epic ® Biosensor Technology PerkinElmer Label-free Enabled Microplates Body Split Grating Sensor

28 28 Le principe de lecture Fenêtre de détection 150 nm Source lumineuse à large spectre Longueur d’onde réfléchie Mesurée par le lecteur La majeure partie de la lumière est transmise Mesure du changement d’indice de réfraction de la zone voisine du bio-détecteur (150 nm)

29 29 Applicable aux tests biochimiques ET Cellulaires Liaison de molécules  Changement de masse  Changement d’indice de réfraction  Modification de longueur d’onde réfléchie Redistribution dynamique de masse  Changement d’indice de réfraction  Modification de longueur d’onde réfléchie Test biochimiques Ligand Protéine Redistribution de masse Tests cellulaires Cellule Fenêtre de détection

30 30 Quelques exemples d’applications: Biochemical Applications Assay Development Aggregation Direct Binding Assay With Nuclear Receptors Fragment Screening Functional Enzyme Assays HTS Kinases & Proteases Microarray Protein-Oligo (DNA / RNA) Interactions Protein:Protein Receptor – Antibody Binding Antibody – Antibody Binding Small Molecule Binding Antibodies / Biologics Cell-Based Applications Antibodies / Biologics Cells: Endogenous & Recombinant Primary & Stem Adherent & Suspension Freshly Cultured & Frozen Patient Samples Cell Adhesion Chemotaxis Cytotoxicity GPCRs GPCR Heterodimerization Ion channels Nuclear Hormone Receptors Phagocytosis Receptor Tyrosine Kinases Toll-like Receptors (TLRs) Transient Transfections Viral infection

31 31 Particularité des plaques pour tests biochimiques: L ’autoréférençage Deux zones dans chaque puits : référençage interne –Zone “Signal” : liaison covalente de protéines par couplage amine –Zone “Référence” : pas de liaison possible –Compense l’impact de facteurs influençant l’indice de réfraction (DMSO, tampon, température, etc) Zone “Référence” Zone “Signal” Lecture de chaque zone sig – ref = réponse mesurée Avantages pour le criblage de petites molécules & fragments: Pas de puits “sacrifiés” pour les contrôles négatifs. Facteur Z’ plus performant qu’en utilisant des puits contrôles adjacents

32 32 Lecture de la ligne de base Principe de base du système Epic : tests biochimiques Ajout de la protéine cible Y Y Lavage Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Ajout du composéLecture finale Réponse = Liaison Longueur d’onde réfléchie Zone Signal Zone Réf Composé Signal post liaison Tampon Mesure (pm) Zone Référence Signal de base Zone Signal

33 33 Test de liaison de petites molécules à l’anhydrase carbonique * CBS = 4-carboxybenzenesulfonamide [drug] = 5uM Buffer = 1xPBS/0.1% DMSO N = 8 K D = 795 nM R 2 = Response (pm) Dansylamide (nM) Dansylamide (250 Da) Literature K D : 760 nM Response (pm) Sulpiride (  M) K D = 127 uM R 2 = 0.99 Sulpiride (341 Da) Literature K D : 186 uM

34 34 Label-free détection d’activité cellulaire:

35 35 Principe de base de la technolgie Epic: tests cellulaires Source lumineuse large spectre Longueur d’onde réfléchie Substrat Guide d’onde Surface Lecture de la ligne de base λi Cellule Lecture finale Λf delta en pm signe la réponse cellulaire Y Y Fenêtre de Détection 150 nm Liaison du ligand au récepteur  Redistribution de masse dans la cellule et/ou modifications morphologiques  Changement de l’indice de réfraction

36 36 Le label-free peut mesurer différentes activités cellulaires … Courtesy of Len Kaczmarek, Yale University Ion Channels Receptor Tyrosine Kinases EGF in A431 cells Toll-Like Receptors dose-dependant activation of TLR3 in A549 Courtesy of Moonsoo Jin, Cornell University Viral Infection HeLa cells Cytotoxicity Emetidine-induced toxicity on Cardiomyocytes Cell-based applications GPCR

37 37 En résumé… La technologie Label-Free EnSpire -Est basée sur les propriétés d’un détecteur optique mesurant des changements d’indice de réfraction -Permet de réaliser des tests biochimiques et cellulaires sans marquage -Est une méthode de lecture non invasive permettant de générer des profils cinétiques riches en information -Permet d’éviter les faux positifs dûs à l’autofluorescence de composés ou aux molécules de marquage elles-même -Est un système de haute sensibilité et rapide

38 L’apport de l’EnSpire  Augmentation de la flexibilité/valeur ajoutée:  Biopuces en formats lames et microplaques  Plus grand choix du support en fonction du nombre d’échantillon à traiter  Approches complémentaires au SPRI et aux puces à protéines  Renforcement de l’expertise :  Profiling de l’expression protéique  AlphaLISA/AlphaScreen  Criblage d’activités biologiques  AlphaLISA/AlphaScreen et label free  Caractérisation / Validation des interactions  label free Activité niche en protéomique fonctionnelle  Exemples d’applications dans les domaines de la santé et des biotechnologies

39  Renforcement de l’expertise :  Profiling de l’expression protéique  AlphaLISA/AlphaScreen  Criblage d’activités biologiques  AlphaLISA/AlphaScreen et label free  Caractérisation / Validation des interactions  label free  Exemples d’applications dans les domaines de la santé et des biotechnologies Activité niche en protéomique fonctionnelle

40 AlphaScreen Surefire : exemples Cellules sensibles au traitement Cellules résistantes au traitement Taux de phosphorylation basal de STAT5 lorsque les cellules sont résistantes à un traitement

41 AlphaScreen Surefire : exemples Kit Dβ Phosphorylation de STAT5 sur 2 lignées cellulaires stimulées par différentes cytokines Cytokine 1 Cytokine 2 Cytokine 3 Cytokine 1 Cytokine 1 Cytokine 2 Cytokine 3

42 AlphaScreen Surefire : exemples Suivi du taux de STAT5 phosphorylé suivant le temps de stimulation par différents agonistes Composé 1 Composé 2 Composé 3

43 WT mutant 1 mutant 2 mutant 3 WT mutant 1 mutant 2 mutant 3 Avec ATP Sans ATP Interaction de Rad51 avec l’ADN Label free : test biochimique 1 Coating Streptavidine 2 Fixation ADN biot 3 Lecture ligne de base 4 Ajout Rad51 5 Lecture streptavidine Rad 51 ADN biot

44 1 Coating protéine 2 Lecture ligne de base 3 Ajout composé 4 Lecture Protéine 25 KDa Composé chimique 500 Da Binding d’un composé chimique sur une protéine Label free : test biochimique

45 Organigramme Faculté des sciences Pierre Weigel UMR CNRS UFIP/ Université de Nantes IRS Yannick Jacques, UMR INSERM U892 CNRS 6299 Responsable technique Cathy Charlier, IE Université Tel Puce à protéine Microcalorimétrie BRET/FRET-HTF Fabien Gautier CR Biacore - SPRi Enspire Technologie alpha Lauranne Paillard IE Technical approaches for BioManufacturing, Biomarker & Drug Discovery services Responsables scientifiques Enspire Label free Lauranne Paillard IE Responsable technique Mike Maillasson, IE INSERM Tel Ingénieur Qualité – Lauranne Paillard IE Dichroïsme circulaire, Fluorescence et anisotropie de fluorescence Fabrice Fleury Institut de Recherche en Santé de l'Université de Nantes (IRS-UN)

46 46 Cathy Charlier Faculté des sciences 2 rue de la Houssinière Nantes CEDEX 3 Tel Contacts Mike Maillasson Institut de Recherche Scientifique Centre de Recherche en Cancérologie (CRCNA) 8, Quai Moncousu NANTES Cedex1 Tel

47 The End

48 Back up slides

49 AlphaLISA Kits

50 50 AlphaScreen SureFire : 45 biomarkers Cancer Immunity Diabetes Inflammation CNS & Neuro-degeneration Caspase 9 (S196) I  Bα (S32/36) IKKα (S176/180) IKKß (S177/181) NF  B p65 (S536) JNK1/3 (T183/Y185) c-Jun (S63, S73) MKK3/6 (S189 or S207) P38 MAPK (T180/Y182) Smad 2 (S465/467) Smad3 (S423/425) Total Akt1 Total Akt 1/2/ (3) Akt 1/2/3 (T308) Akt 1/2/3 (S473) Akt1 (T308) Akt1 (S473) mTOR (S2481, S2448) p70S6K (T229, T389, T421/S424) PDK-1 (S241) Stat-1 (Y701) Stat-3 (Y705) Stat-5 (Y694/699) total GAPDH Internal Standard BAD (S112) BAD (S136) GSK3α (S21) GSK3ß (S9) Insulin receptor β (Y1150/1151) 4EBP1 (T70 and T37/46) MEK-1 (S217/221) ERK 1/2 (T202/Y204) Total ERK ½ Elk-1 (S383) eiF4E (Ser209) Total ALK ALK (Y1586) ALK (Y1604) RPS6 (S235/236, S240/244) Chk1 (S345) Chk2 (T68) IGF-1 receptor β (Y1135/1136) EGF receptor (Y1068) ErbB2 (Y1221/1222) VEGF receptor 2 (Y1175)

51 51 Alpha Beads Characteristics Strepatividin coated Donor beads Antibody coated Acceptor beads SA/bead = nM SA Ab/bead = 2-3 nM Ab 1 µg beads = 2 x10 8 beads 1 bead = g = 0, nanograms! Alpha Beads Made of polysterene Ø ~250 nm: very stable colloidal suspension Beads Density = : very slow sedimentation in water! Dextran polymer coating - prevent NS interaction (aggregation) - reactive aldehyde groups (raw beads)

52 52 O S N O S N O O O S N O O  g   O S N O S N O O O S N O O g   O S N O S N O O O S N O O g   O S N O S N O O O S N O O g   nm TAR beads (AlphaScreen) Eu-based beads (AlphaLISA) Rubrene emission : nm Detection: nm Eu emission : nm Detection: nm nm nm Eu energy transfer AlphaLISA: New Europium Acceptor Beads

53 53 AlphaLISA Acceptor Beads Normalized AlphaScreen vs AlphaLISA Emission Spectra AlphaLISA Emission AlphaScreen Emission nm Relative Fluorescence units (%)  Stronger signal with AlphaLISA Acceptor beads  Less prone to matrix interferences (Hemoglobin)  Optimized for serum and plasma samples Minimal inner filter effects in plasma/serum

54 54 Hemoglobin interference nm  (cm -1 /M) Hb.O 2 absorbance Rubrene emission wavelength of lanthanide chelates excitation wavelength of lanthanide chelates emission … hemoglobin has a broad and intense absorbance spectrum up to 600 nm AlphaLISA Beads emit out of this area.

55 55 AlphaScreen Working Range : Affinities 1 highest biological interaction 2 biotin-streptavidin 3 very high affinity ab, receptor ligands 4 most antibodies of good quality 5 most protein-protein interactions 6 lectins aMfMpMnM µMmM AlphaScreen Filtration assays, FP ELISA-like TR-FRET

56 56 Why can we detect very low affinity interactions with Alpha? Ni2+ chelate Donor beads Anti-GST (or GSH) Acceptor beads 6His-Protein nM concentrations of binding partners can generate high local concentrations of protein complexes reaching  M levels between beads GST-Protein “AVIDITY” effect


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