Intervenant(s) : Lauranne Paillard; Virginie Goubert

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1 Intervenant(s) : Lauranne Paillard; Virginie Goubert
Titre de l’atelier : Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires Intervenant(s) : Lauranne Paillard; Virginie Goubert

2 Atelier protéomique fonctionnelle :
Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires

3 Nouvelles approches pour l’étude des interactions moléculaires
Partie 1 Présentation de la plate forme Lauranne Paillard-Laurance Ingénieure Partie 2 Présentation des technologies Alpha et Label free Virginie Goubert Drug discovery application specialist Partie 3 Applications et exemples réalisés sur la plate forme

4 Interactions Moléculaires Puces ACTivités
L. Paillard-Laurance Gen2Bio 3 avril 2014 Saint-Malo

5 6 axes technologiques : 4 domaines d'activité Le réseau Biogenouest
6 axes technologiques : 4 domaines d'activité 29 plates-formes technologiques Plus de 70 unités de recherche Génomique Protéomique Exploration fonctionnelle Bio-imagerie Analyse structurale et métabolomique Bio-informatique Mer Agro Santé Bio-informatique

6 Axe Protéomique Animateur : Charles Pineau & P. Weigel
Nantes Rennes Axe Protéomique Animateur : Charles Pineau & P. Weigel Identification–Caractérisation à haut débit Charles Pineau Interactions moléculaires puces activités (IMPACT) Yannick Jacques et Pierre Weigel

7 Analyse des interactions / recherche de partenaires
Protéomique Caractérisation des PROTEines exprimées par un génOME dans un système biologique déterminé. Etude des protéines à grande échelle par des méthodes de biochimie et de biologie structurale en relation avec les données du génome Cartographie et identification des protéines Trois domaines: Structure / Fonctions Analyse des interactions / recherche de partenaires

8 Dans un système biologique donné
Interactomique Etude de l’ensemble des interactions entre les protéines d’un organisme Objectifs Connaître la liste des gènes et des protéines d’un organisme Savoir comment ces éléments interagissent En pratique Déterminer quelles protéines interagissent avec quelles autres Dans un milieu dynamique (cellule vivante) Innombrables réactions chimiques à chaque seconde Solutions 1. Etudier le contenu (cartographie) 2. Etudier les interactions dans leur contexte cellulaire naturel 3. Etudier dans le détail chaque interaction Dans un système biologique donné

9 Les 3 activités de la plateforme Impact
1. Activité de services 1. Aide méthodologique 2. Projets collaboratifs 2. Activité de R&D 3. Activité de formation 50 % de projets en interne 50% de projets externes Démarche qualité – certification Iso 9001 à court terme

10 Pourquoi venir sur la plate forme Impact ?

11 Activité niche en protéomique fonctionnelle
Expertise : Profiling de l’expression protéique Criblage d’activités biologiques Caractérisation / Validation des interactions Applications dans les domaines de la santé et des biotechnologies

12 Expertise Technologies Profiling Criblage Caractérisation Validation
Etude du profil d’expression de protéines Analyse de la modulation des modifications post-traductionnelles de protéines : phosphorylation, ubiquitination, SUMOylation glycosylation… Puces à protéines SPR imaging Criblage Criblage modèle dédiés à l’étude de la fonctionnalité de récepteurs membranaires Criblage de chimiothèques sur la base de modèles SPR BRET FRET Label free, Alpha Caractérisation Validation Validation de l’interaction protéine/ligand Détermination de l’affinité Etude des paramètres thermodynamiques iTC Label free Fluorescence Contrôle qualité Analyse de l'intégrité structurale ou de la fonctionnalité Evaluation de la pureté de protéines Bioanalyzer Dichroisme circulaire

13 Equipements de la plate forme Impact Technologies Alpha et Label Free
Biacore 2000 / 3000 SPRiplex II Technologies Alpha et Label Free EnSpire Puces à protéines sciFLEXARRAYER S3 (Scienion) Profiling Criblage Caractérisation Contrôle HTRF / BRET / FRET / AF Mithras LB940 Fluorescence/anisotropie fluorescence Spectrofluorimètre FP-6500 Photomètre de polarisation de fluorescence FP-715 Microcalorimètre Auto iTC200 Dichroïsme Circulaire et linéaire Spectropolarimètre J-810

14 Equipements de la plate forme Impact Technologies Alpha® et Label Free
Sur l’EnSpire

15 Alpha Technology

16 Alpha®: Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay
Bead-based - Donor and Acceptor Beads Homogeneous - no wash steps Versatility - Detects virtually any molecule from large endogenous protein complexes to very small peptides Works in a variety of sample types including serum, plasma, cell lysates and cell supernatant High sensitivity (fmol) - Amplified signal Low background - Emission wavelength is lower than Excitation Based on AS. Bead based luminscent assay. Donor beads and Acceptor beads. When binding partners bring these 2 beads into close proximity there can be transfer of E between the beads. Upon laser excitation the donor bead produces a oxygen singlet that can excite the Acceptor bead which then emit light at nm Advantage of AS: large distance between beads (up to 400nm) allows measurement of intereactions between large molecules.

17 Alpha Toolbox for Assay Development
Donor Beads Unconjugated Ni2+ chelate Glutathione (GSH) Protein A Anti-FLAG Anti-mouse IgG Anti-Rabbit IgG Strep-Tactin Optimization kits TruHits Omnibeads AlphaLISA Acceptor Beads Protein A Protein G Protein L Anti-human IgG Anti-rabbit IgG Anti-mouse IgG Anti-mouse IgM Anti-rat IgG Anti-goat IgG Anti-sheep IgG Anti-chicken IgY Streptavidin Nickel chelate Glutathione (GSH) Anti-FLAG Anti-GST Anti-c-myc Anti-DIG Anti-FITC Anti-V5 Anti-GFP Anti-MBP Strep-Tactin To develop protein-protein interaction assays, researchers can rely on the AlphaScreen and AlphaLISA toolbox reagents. Further to unconjugated Acceptor and Donor beads, toolbox reagents include a wide variety of beads allowing one to capture proteins through fusion tags (GST, His, Flag, c-Myc, HA, V5, GFP and StrepTag). Beads conjugated with protein A, G and various anti-species antibodies allows the capture of primary antibodies through their heavy chains whereas, Protein L coated beads allows the capture antibody light chains.

18 Alpha: A broad assay platform
>120 Biomarker kits (immunoassays – ELISA conversion) 86 SureFire kits for protein phosphorylation >20 reagents to measure the activity of epigenetic enzymes > 10 kits for cell-based epigenetics assays cAMP, cGMP determination Biotherapeutics analysis: PK, PD, ADA assays (immunoassays), clone screening, isotyping, functional testing, Host- cell contaminants , … Toolbox: Even more flexibility to develop: Other biomarkers, all the above but as custom kits, ... Protein-protein interactions, Protein-DNA interaction, Protein-RNA interaction, Protein-small molecule interaction, Cellular markers or signaling, Biochemical Binding Assays…..ie. Receptor + Ligand/Mab Virtually any assay can be developed, as long as you can bring the beads together Beside Toolbox: Epigenetics Biomarkers and cytokines SureFire cellular kinase Protein-Protein interaction Assay Dev service, custom labeling service Homogeneous assays: Few steps, faster data generation Improved CV compared to wash assays Reduced consumption of sample Compatible with multiple types of samples

19 Low affinity protein-protein interaction:p53/hDM2 (µM range)
400000 300000 AlphaScreen Signal (cps) 200000 Total Non Specific 100000 2 4 6 8 10 12 p53 peptide [GST-HDM2] (nM) anti GST 400000 300000 AlphaScreen Signal (cps) La protéine hdm2, surexprimée dans les cellules cancereuses, bloque la fonction de la p53 en se liant à son site d’activation. 1 0.61 2 0.58 5 0.90 10 1.10 [GST-HDM2] (nM) IC 50 ( m M) 200000 100000 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 log [p53 peptide] (M)

20 Cellular assay for measuring p65-IkBa interaction
Protein-protein interactions could be also studied in a cellular context. The example presented on this slide was developped by PerkinElmer R&D scientists using AlphaLISA reagents. The assay aimed at measuring the interaction prevailing between IkBa and p65 in Hela cells. Using antibodies specific to IkBa and p65 epitopes non-overlapping with their binding interface, AlphaLISA assays were developed to measure the IkBa/p65 complex and IkBa or p65 alone in cellular extracts. After treating Hela cells with increasing dose of TNFa, one can measure the concomitant disappearance of the IkBa/p65 complex and IkBa due to the degradation of the latter protein. Levels of p65 remained unchanged. The assay also allowed to measure the kinetics of IkBa/p65 disappearance: as reported by other groups using traditional Western Blotting technique, the phenomenon is transitory and IkBa/p65 is reformed after one hour following the accumulation of newly available IkBa.

21 AlphaLISA comparison to ELISA
How does AlphaLISA compare to traditional ELISA? AlphaLISA is bead based, technically different…but similar in functionality (sandwich assay in solution) No wash vs wash (time consuming) Scalable (from 96-well to 1536-well) Very wide dynamic range AlphaLISA 2-incubation step protocol for most assays: Just 4 steps to results Add standard or sample Add mix: biotinylated Ab & acc beads 60 min incubation Add donor beads Read ELISA

22 Alpha Molecular Weight Range for Targets
AlphaLISA can cover a wide range of sizes: - Giant particles (100MDa+) ex. M13 phages - Huge proteo-glycans (1MDa+) ex. chondroitine - Large proteins (150kDa+) ex. hIgG - Medium protein (50kDa+) ex. trimeric TNFa - Small protein (5kDa+) ex. insulin - Large peptides (30aa+) ex. Aß42 - Small peptides (5-30aa) ex. Angiotensin I - Small molecules ex. cAMP

23 Detection of phospho-Kinases in Cell lysates with SureFire kits
Homogeneous Cell-based assay Highly sensitive: Over-expressed and endogenous receptors Receptor-mediated signaling modulation: GPCRs, Receptors Tyr Kinases, Cytokine Receptors, Inflammatory responses Intracellular kinase signaling cascade modulation: monitor a single target or multiple targets Use in many different cell lines, incl. Primary Cells

24 Stimulation of Endogenous Bombesin Receptors
Measurement of ERK phosphorylation in Swiss 3T3 cells % Activation Log [Bombesin] (M) 10-10 20 40 60 80 100 120 10-9 10-8 10-7 10-5 10-6 [Bombesin] Western blot pERK1/2 10 µM 40 pM AlphaScreen® SureFire™ Cellular ERK assay GPCR Activation

25 Label-Free Technology

26 PKI + Epic = EnSpire Label-Free
4/6/2017 EnSpire® Multimode Reader + Epic® Generation 2 Label-free Reader = The First Multimode Bench-top Instrument With Label-free Capability For Both Cell-based & Biochemical Assays!

27 PerkinElmer Label-free Enabled Microplates
4/6/2017 Body Split Grating Sensor High Quality Label-free Microplates Incorporate Patented Epic® Biosensor Technology 27

28 Le principe de lecture Mesure du changement d’indice de réfraction de la zone voisine du bio-détecteur (150 nm) Fenêtre de détection 150 nm Source lumineuse à large spectre Longueur d’onde réfléchie Mesurée par le lecteur La majeure partie de la lumière est transmise 28

29 Applicable aux tests biochimiques ET Cellulaires
Redistribution de masse Tests cellulaires Cellule Test biochimiques Ligand Protéine Fenêtre de détection Liaison de molécules  Changement de masse Changement d’indice de réfraction Modification de longueur d’onde réfléchie Redistribution dynamique de masse  Changement d’indice de réfraction Modification de longueur d’onde réfléchie

30 Quelques exemples d’applications:
Biochemical Applications Assay Development Aggregation Direct Binding Assay With Nuclear Receptors Fragment Screening Functional Enzyme Assays HTS Kinases & Proteases Microarray Protein-Oligo (DNA / RNA) Interactions Protein:Protein Receptor – Antibody Binding Antibody – Antibody Binding Small Molecule Binding Antibodies / Biologics Cell-Based Applications Antibodies / Biologics Cells: Endogenous & Recombinant Primary & Stem Adherent & Suspension Freshly Cultured & Frozen Patient Samples Cell Adhesion Chemotaxis Cytotoxicity GPCRs GPCR Heterodimerization Ion channels Nuclear Hormone Receptors Phagocytosis Receptor Tyrosine Kinases Toll-like Receptors (TLRs) Transient Transfections Viral infection

31 Particularité des plaques pour tests biochimiques: L’autoréférençage
Deux zones dans chaque puits : référençage interne Zone “Signal” : liaison covalente de protéines par couplage amine Zone “Référence” : pas de liaison possible Compense l’impact de facteurs influençant l’indice de réfraction (DMSO, tampon, température, etc) Lecture de chaque zone sig – ref = réponse mesurée Zone “Référence” “Signal” Avantages pour le criblage de petites molécules & fragments: Pas de puits “sacrifiés” pour les contrôles négatifs. Facteur Z’ plus performant qu’en utilisant des puits contrôles adjacents < delta >

32 Principe de base du système Epic : tests biochimiques
Y Y Lecture de la ligne de base Ajout de la protéine cible Ajout du composé Lavage Lecture finale Y Y Y Y Tampon Mesure (pm) Zone Référence Signal de base Zone Signal Composé Signal post liaison Zone Signal Zone Réf Longueur d’onde réfléchie Réponse = Liaison

33 Test de liaison de petites molécules à l’anhydrase carbonique
KD = 795 nM R2 = 0.98 1000 2000 3000 4000 5000 6000 0.0 Response (pm) 2.5 5.0 7.5 10.0 Dansylamide (nM) Dansylamide (250 Da) Literature KD: 760 nM [drug] = 5uM Buffer = 1xPBS/0.1% DMSO N = 8 100 200 300 400 500 600 3 6 9 12 Response (pm) Sulpiride (mM) KD = 127 uM R2 = 0.99 Sulpiride (341 Da) Literature KD: 186 uM * CBS = 4-carboxybenzenesulfonamide

34 Label-free détection d’activité cellulaire:

35 Principe de base de la technolgie Epic: tests cellulaires
Liaison du ligand au récepteur Fenêtre de Détection 150 nm Y  Redistribution de masse dans la cellule et/ou modifications morphologiques Changement de l’indice de réfraction Y Cellule Surface Guide d’onde Substrat Slow down movement, show binding event Explore shrinkage option Lecture de la ligne de base λi Lecture finale Λf delta en pm signe la réponse cellulaire Source lumineuse large spectre Longueur d’onde réfléchie

36 Le label-free peut mesurer différentes activités cellulaires …
GPCR Receptor Tyrosine Kinases EGF in A431 cells Toll-Like Receptors dose-dependant activation of TLR3 in A549 Courtesy of Len Kaczmarek, Yale University Ion Channels Courtesy of Moonsoo Jin, Cornell University Viral Infection HeLa cells Cytotoxicity Emetidine-induced toxicity on Cardiomyocytes We have successfully demonstrated that the EnSpire system can be applied to the detection of cellular responses for many classes of endogenous & over expressed targets, including…. Here are some examples of DMR signals associated with GPCR, Ion channel & RTK activities . As you can see, the temporal changes of these DMR responses are very different for different targets………………. Cell-based applications

37 La technologie Label-Free EnSpire
En résumé… La technologie Label-Free EnSpire Est basée sur les propriétés d’un détecteur optique mesurant des changements d’indice de réfraction Permet de réaliser des tests biochimiques et cellulaires sans marquage Est une méthode de lecture non invasive permettant de générer des profils cinétiques riches en information Permet d’éviter les faux positifs dûs à l’autofluorescence de composés ou aux molécules de marquage elles-même Est un système de haute sensibilité et rapide

38 Activité niche en protéomique fonctionnelle
L’apport de l’EnSpire Augmentation de la flexibilité/valeur ajoutée: Biopuces en formats lames et microplaques Plus grand choix du support en fonction du nombre d’échantillon à traiter Approches complémentaires au SPRI et aux puces à protéines Renforcement de l’expertise : Profiling de l’expression protéique  AlphaLISA/AlphaScreen Criblage d’activités biologiques  AlphaLISA/AlphaScreen et label free Caractérisation / Validation des interactions  label free Exemples d’applications dans les domaines de la santé et des biotechnologies

39 Activité niche en protéomique fonctionnelle
Renforcement de l’expertise : Profiling de l’expression protéique  AlphaLISA/AlphaScreen Criblage d’activités biologiques  AlphaLISA/AlphaScreen et label free Caractérisation / Validation des interactions  label free Exemples d’applications dans les domaines de la santé et des biotechnologies

40 AlphaScreen Surefire : exemples
Taux de phosphorylation basal de STAT5 lorsque les cellules sont résistantes à un traitement Cellules sensibles au traitement Cellules résistantes au traitement

41 AlphaScreen Surefire : exemples
Phosphorylation de STAT5 sur 2 lignées cellulaires stimulées par différentes cytokines Kit 225 32Dβ Cytokine 1 Cytokine 1 Cytokine 2 Cytokine 3 Cytokine 1 Cytokine 2 Cytokine 3

42 AlphaScreen Surefire : exemples
Suivi du taux de STAT5 phosphorylé suivant le temps de stimulation par différents agonistes Composé 1 Composé 2 Composé 3

43 Label free : test biochimique
Interaction de Rad51 avec l’ADN WT mutant 1 mutant 2 mutant 3 Avec ATP Sans ATP streptavidine Rad51 ADN biot 1 Coating Streptavidine 2 Fixation ADN biot 3 Lecture ligne de base 4 Ajout Rad51 5 Lecture

44 Label free : test biochimique
Binding d’un composé chimique sur une protéine Protéine 25 KDa Composé chimique 500 Da 1 Coating protéine 2 Lecture ligne de base 3 Ajout composé 4 Lecture

45 Organigramme Responsables scientifiques Faculté des sciences IRS
Pierre Weigel UMR CNRS UFIP/ Université de Nantes IRS Yannick Jacques, UMR INSERM U892 CNRS 6299 Institut de Recherche en Santé de l'Université de Nantes (IRS-UN) Responsable technique Cathy Charlier, IE Université Tel Responsable technique Mike Maillasson, IE INSERM Tel Puce à protéine Microcalorimétrie Enspire Label free Lauranne Paillard IE BRET/FRET-HTF Fabien Gautier CR Biacore - SPRi Enspire Technologie alpha Lauranne Paillard IE Dichroïsme circulaire, Fluorescence et anisotropie de fluorescence Fabrice Fleury Technical approaches for BioManufacturing , Biomarker & Drug Discovery services Ingénieur Qualité – Lauranne Paillard IE

46 http://www.impact-plateforme.com Contacts Cathy Charlier
Faculté des sciences 2 rue de la Houssinière Nantes CEDEX 3 Tel Mike Maillasson Institut de Recherche Scientifique Centre de Recherche en Cancérologie (CRCNA) 8, Quai Moncousu NANTES Cedex1 Tel

47 The End

48 Back up slides

49 AlphaLISA Kits

50 AlphaScreen SureFire : 45 biomarkers
Cancer 4EBP1 (T70 and T37/46) Immunity MEK-1 (S217/221) ERK 1/2 (T202/Y204) Total ERK ½ Elk-1 (S383) Chk1 (S345) Chk2 (T68) RPS6 (S235/236, S240/244) Caspase 9 (S196) Total ALK ALK (Y1586) ALK (Y1604) c-Jun (S63, S73) MKK3/6 (S189 or S207) P38 MAPK (T180/Y182) Stat-1 (Y701) Stat-3 (Y705) Stat-5 (Y694/699) eiF4E (Ser209) Smad 2 (S465/467) Smad3 (S423/425) EGF receptor (Y1068) ErbB2 (Y1221/1222) VEGF receptor 2 (Y1175) Total Akt1 Total Akt 1/2/(3) Akt 1/2/3 (T308) Akt 1/2/3 (S473) Akt1 (T308) Akt1 (S473) mTOR (S2481, S2448) p70S6K (T229, T389, T421/S424) PDK-1 (S241) IkBα (S32/36) IKKα (S176/180) IKKß (S177/181) NFkB p65 (S536) IGF-1 receptor β (Y1135/1136) Insulin receptor β (Y1150/1151) The AlphaScreen SureFire portfolio is composed of kits allowing one to measure the activity of various kinases in different cell lines, namely recombinant/immortalized, primary and even stem cells. SureFire assays are also useful to measure kinase activity in tissues (brain, liver). Using Surefire, researchers can study different kinase markers predictive of disease state including, cancer, cardiovascular, neurodegeneration, inflammation and metabolic disorders. GSK3α (S21) GSK3ß (S9) JNK1/3 (T183/Y185) Diabetes BAD (S112) BAD (S136) Inflammation Internal Standard CNS & Neuro-degeneration total GAPDH

51 Alpha Beads Characteristics
Made of polysterene Ø ~250 nm: very stable colloidal suspension Beads Density = : very slow sedimentation in water! Dextran polymer coating - prevent NS interaction (aggregation) - reactive aldehyde groups (raw beads) Strepatividin coated Donor beads Antibody coated Acceptor beads SA/bead = nM SA Ab/bead = 2-3 nM Ab 1 µg beads = 2 x108 beads 1 bead = g = 0, nanograms!

52 AlphaLISA: New Europium Acceptor Beads
TAR beads (AlphaScreen) Eu-based beads (AlphaLISA) O S N energy transfer 1D g 2 N N N N N N N N N N N N S S S S S S S S O O O O O O O O 1D 1D 1D 1D S S S S g g g g O O O O 2 2 2 2 nm O O O O O O O O O O O O O O O O O O O O nm nm energy transfer Eu Rubrene emission : nm Detection: nm Eu emission : nm Detection: nm

53 AlphaLISA Acceptor Beads
Normalized AlphaScreen vs AlphaLISA Emission Spectra 120 AlphaScreen Emission 100 AlphaLISA Emission 80 Relative Fluorescence units (%) 60 40 20 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 Stronger signal with AlphaLISA Acceptor beads Less prone to matrix interferences (Hemoglobin) Optimized for serum and plasma samples nm Minimal inner filter effects in plasma/serum

54 Hemoglobin interference
500 550 600 650 25000 50000 75000 Hb.O 2 absorbance Rubrene emission nm e (cm-1 /M) 250 300 350 400 450 500 550 600 650 100000 200000 300000 400000 500000 600000 nm e (cm-1 /M) Hb.O2 absorbance Rubrene emission wavelength of lanthanide chelates emission wavelength of lanthanide chelates excitation … hemoglobin has a broad and intense absorbance spectrum up to 600 nm AlphaLISA Beads emit out of this area.

55 AlphaScreen Working Range : Affinities
1 highest biological interaction 2 biotin-streptavidin 3 very high affinity ab, receptor ligands 4 most antibodies of good quality 5 most protein-protein interactions 6 lectins 1 2 3 4 5 6 aM fM pM nM µM mM AlphaScreen Filtration assays, FP ELISA-like TR-FRET

56 Why can we detect very low affinity interactions with Alpha?
6His-Protein GST-Protein Ni2+ chelate Donor beads Anti-GST (or GSH) Acceptor beads nM concentrations of binding partners can generate high local concentrations of protein complexes reaching mM levels between beads “AVIDITY” effect