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Utilisation du Cryo-SEM pour l’étude du fonctionnement hydraulique des plantes Hervé Cochard, Christian Bodet UMR-PIAF, INRA, Clermont-Ferrand 3èmes Journées.

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1 Utilisation du Cryo-SEM pour l’étude du fonctionnement hydraulique des plantes Hervé Cochard, Christian Bodet UMR-PIAF, INRA, Clermont-Ferrand 3èmes Journées de formation du Réseau des Centres Commun de Microscopie Université de Rouen- Maison de l’université 3 et 4 Juin 2004

2 Le Cryo-SEM en qqes mots: SEM classique (Philips SEM 505) Étage cryogénique T < -80°C (Hexland CT 100) –Observation –Métallisation En dessous du point de sublimation de la glace Observation d’échantillons hydratés mais congelés Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation (méthode directe)

3 Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal Photos: C BodetÉpiderme d’une feuille

4 Photos: C Bodet Coupe d’une feuille (cryo-fracture) Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal

5 Anatomie d’une aiguille de Pin

6 Circulation des sèves dans l’arbre CO 2 Sève élaborée Riche en sucres Descendante Phloème H2OH2O Sève brute Eau Ascendante Xylème Croissance de l’arbre

7 Deux phénomènes à mettre en évidence Présence de bulles d’air dans les vaisseaux conducteurs (embolie) Normal Collapsé Déformation de la paroi des vaisseaux (collapse) From: Piquemal et al 1998

8 Observation du xylème au SEM Échantillons prélevés et déshydratés

9 Observation du xylème au cryo-SEM Risques de sublimation de la glace (cryo-décapage ou métallisation)

10 Betula platyphylla, Utsumi et al 1998 Observation du xylème au cryo-SEM Échantillons prélevés puis congelés LN 2 Cryo-fracture Cryo-microtome

11 La nombre de vaisseaux embolisés dépend du point d’observation Nombre de vaisseaux embolisés Distance à la coupe millimètres Pétiole de Noyer Tyree, Cochard, Cruiziat PCE 2003.

12 Circulation de la sève brute Évaporation Sol : Eau diluée Xylème: Tubes Parois rigides Feuilles: Surface poreuse Feuilles : Pompe aspirante

13 Un système vasculaire sous tension (dépression) Sol : Eau diluée La sève brute est aspirée par dépression La « pompe aspirante » se désamorce L’appareil vasculaire s’embolise

14 Photo: C Bodet, INRA-PIAF L’appareil vasculaire est constitué de conduits de dimensions variables mais finies vaisseau Terminaison de vaisseau La sève se retire sur toute la longueur des vaisseaux Perturbation du contenu des vaisseaux lors du prélèvement des échantillons

15 Cochard et al Plant Physiol 2000 Cryo-SEM LN2 Observation du xylème au cryo-SEM Échantillons congelés sur l’arbre puis prélevés

16

17 -0.7 MPa 10 µm >-0.03 MPa! -0.7 MPa Le paradoxe du Cryo-SEM Les mesures de tension de sève sont-elles erronées ? Les observations au cryo-SEM sont-elles erronées ?

18 Cryo-SEM LN2 Importance du mode préparatoire des échantillons Water Échantillons recoupés sous eau puis congelés

19 Water LN2 + Variations journalières d’embolie dans un pétiole de noyer

20 Vitesse de congélation des échantillons par LN 2 LN2 T,°C Artéfact de congélation

21 Collapsus des parois Étude des phénomènes de collapse LN2 Cochard et al, Plant Physiol 2004

22 Mise en évidence du phénomène de collapse par cryo-SEM dans des aiguilles de Pinus cembra Aiguille bien hydratée

23 Pinus cembra -4 MPa Aiguille fortement déshydratée

24 Pinus cembra -4.6 MPa Aiguille très fortement déshydratée

25 Eau 2 min Importance du mode préparatoire des échantillons LN2

26 Conclusions Pour le xylème: la fiabilité des observations est très dépendante de la préparation des échantillons. Possibilités d’artéfacts et d’interprétations erronées des observations. –Embolie : recouper sous eau –Collapse : ne pas recouper sous eau ! Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation ?


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