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La cytométrie en flux est une technologie qui permet l'analyse quantitative, non destructive et rapide de cellules isolées considérées individuellement:

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Présentation au sujet: "La cytométrie en flux est une technologie qui permet l'analyse quantitative, non destructive et rapide de cellules isolées considérées individuellement:"— Transcription de la présentation:

1 La cytométrie en flux est une technologie qui permet l'analyse quantitative, non destructive et rapide de cellules isolées considérées individuellement: cellules par minute Le cytomètre à flux détecte la fluorescence de marqueurs moléculaires présents à la surface ou à l'intérieur des cellules: - Marqueurs membranaires révélés par immunofluorescence: - Leucémies, typage lymphocytaire, immunophénotype - Marqueurs nucléaires révélés par une sonde fluorescente: - Quantification des acides nucléiques (ADN, ARN) - Cinétique cellulaire des tumeurs. Certains cytomètres à flux sont aussi des trieurs de cellules qui sont alors récoltées, intactes, avec un très haut degré de pureté CYTOMETRIE EN FLUX: DEFINITION ET APPLICATIONS CLINIQUES

2 L’analyse (et le tri) ne se limite pas aux cellules humaines: Toute particule ISOLEE d’une taille supérieure au micron mais inférieure à 400 microns peut être considérée: Bactéries plaquettes chromosomes isolés (= cytogénétique en flux) Mitochondries Champignons unicellulaires, levures Leucocytes Phytoplancton Protoplaste végétal FDC

3 L’obligation d’obtenir des suspensions cellulaires monodispersées implique la destruction de l’organisation tissulaire: La perte du microenvironnement et des relations histologiques est un défaut majeur de la cytométrie en flux Solution: réaliser les mêmes études (sauf le tri) par la technologie complémentaire à la cytométrie en flux: La cytométrie d’images alliant microscopes, caméras, morphologie mathématique et informatique

4 CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX 1.ANALYSE 2.TRI CELLULAIRE 3.APPLICATIONS

5 Un cytofluorimètre-trieur à flux

6 Echantillon Liquide de gaine Injecteur Une cellule Gicleur Faisceau laser Liquide de gaine Veine porteuse (diamètre 70 µm) (diamètre 10 µm) = Flux + Diffusion lumineuse, "Ombre portée" "Taille cellulaire" Fluorescence Le gicleur (« nozzle= tuyère ») Les cellules sont injectées en file indienne et traversent un laser UNE à UNE.

7 FOCALISATION HYDRODYNAMIQUE

8 La grande force de la cytométrie est de considérer chaque cellule INDIVIDUELLEMENT Le cytomètre peut alors: Faire la différence entre un marqueur faiblement exprimé par une grande partie d’une population cellulaire et l’expression forte de ce même marqueur par une minorité de cellules Le cytomètre peut aussi: Détecter, analyser et trier des cellules rares dont l’intérêt biologique peut être considérable.

9 FACTEURS ENDOGENES TISSU NORMAL "CIBLE" FACTEURS EXOGENES CARCINOGENES CELLULES PRENEOPLASIQUES CELLULES NEOPLASIQUES INVASION METASTASES FACTEURS ENDOGENES MODULATION PROMOTION FACTEURS EXOGENES PROMOTION INITIATION PROGRESSION 1 – 1000 cellules ??XXX Millions cellules Cellules rares Cancérogenèse ans

10 Le cytomètre mémorise TOUS les paramètres de CHAQUE cellule considérée INDIVIDUELLEMENT dans une LISTE INFORMATIQUE (list mode) Une cellule différente de à autres cellules peut être retrouvée dans cette liste et analysée Dans ce graphique, chaque point représente UNE cellule: Sur cellules, 14 cellules différentes sont repérées. TémoinTraité

11 Faisceau laser Diffusion lumineuse, "Ombre portée" "Taille cellulaire" Fluorescence Quels sont les paramètres étudiés en cytométrie ? 1)La diffusion lumineuse « Scatters » ( diffraction, réflexion, réfraction), TOUJOURS émise) 2) Les émissions de fluorescence (SI il y a une sonde excitable par le laser)

12 Diffusion lumineuse axiale: La réflexion et diffraction dominent. "Forward Scatter, FSC" Ombre cellulaire, taille relative de la cellule Diffusion lumineuse orthogonale: La réfraction domine "Side Scatter, SSC" Texture cellulaire, granularité. Les « Scatters » : une lumière diffusée DE MEME COULEUR que le laser incident, dont l ’intensité est proportionnelle à la taille (FSC) ou à la granularité (SSC) cellulaire.

13 Le diagramme de dispersion (« Dot plot ») Les scatters sont TOUJOURS émis, même en l’absence de fluorescence. FSC et SSC sont les deux paramètres discriminants fondamentaux.

14 Les Fluorescences sont émises dans TOUTES les directions; elles sont toujours de couleur différente de celle du laser. La couleur est fonction de la nature de la sonde fluorescente L ’intensité de fluorescence est proportionnelle au nombre de molécules- sondes fixées sur la cellule, et donc au nombre de récepteurs-cibles. Un anticorps « vert » reconnaitra un récepteur membranaire. Une sonde « rouge » quantifiera l ’ADN

15 nm Déplacement de Stockes ABSORPTION ET FLUORESCENCE DE PerCP (Peridinine chlorophyll –  -protein complex) a.u

16 FITCTR R-PETandem R-PE*TR PI7-AADB-PE APC PRINCIPAUX FLUOROCHROMES UTILISES EN CYTOMETRIE EN FLUX

17 Les « Fluorescences » et « Scatters » sont SIMULTANEMENT émis dans toutes les directions. Par construction, le cytomètre « regarde » À zéro degré (FSC) et à 90 degrés (SSC et Fluorescences) Détecteurs SSC et fluos Détecteur FSC

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19 . Interprétation d ’un histogramme selon le paramètre mesuré

20 Le diagramme de densité (numérique ): chaque carré représente un GROUPE de cellules, le nombre de cellules du groupe est donné par une FAUSSE COULEUR < > 10000

21 La fenêtre R1 est VOTRE choix !!! Se tromper conduit à des analyses Invalides.

22 Interception laser-Flux = Point d’analyse Barre d'obscuration Détecteur de Diffusion axiale, FSC Détecteur de diffusion orthogonale, SSC Le cytomètre –analyseur.

23 Les filtres optiques:

24 Miroir Dichroïque DM 560 LP: Plaçé à 45°, Il est transparent Aux ondes < 560 nm et réfléchit les ondes > 560 nm BP 520 BP Les filtres BP sélectionnent la bonne fluorescence et sont Le dernier rempart avant les détecteurs FITC R-PE

25 Veine porteuse Une cellule 1,00 0,00 0,95 0,56 1,00 0,99 0,97 Laser #1 Laser #2 Laser #3 ALIGNEMENT LASER - FLUX

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27 Alignement laser/flux et vitesse d ’injection: deux réglages fondamentaux A: optimalB: injection rapide C: flux désaligné D: bouchon

28 Détection et traitement des impulsions lumineuses. Chaque cellule, durant son bref passage dans le laser, émet un flash de lumière par paramètre étudié: -Un flash de scatter axial et orthogonal (il existe des scatters sous d’autres angles, non considérés içi) -Un ou plusieurs flash de fluorescences. Ces flash ou impulsions ne sont pas quelconques: -Leur durée est égale au temps de passage de la cellule dans le laser (temps de vol moyen: 10 microsecondes) -Leur intensité VARIE tout au cours de la traversée du laser !!!!

29 . Les impulsions: chaque cellule émet un « flash » de lumière dont l’amplitude maximale est atteinte au centre du laser et mesurée à cet instant…

30 . La cellule est très petite comparée au laser: Le cytomètre, qui n’est pas équipé d’un objectif de microscope puissant, ne peut pas faire la différence entre une fluorescence nucléaire et une fluorescence de surface: La cellules est considérée comme un point mathématique sans structure apparente. Le cytomètre « voit » la quantité totale de lumière émise par une cellule morphologiquement non résolue On dit que le cytomètre travaille à La résolution zéro. RESOLUTION ZERO

31 Photodiode Filtre neutre 10% Le détecteur de « Scatter axial »(FSC): une simple photodiode. Barre D’obscuration FSC Laser direct électrons

32 + 700 volts Tension PMT volts Le détecteur de fluorescence: Un tube photomultiplicateur (PMT) un amplificateur de lumière: UN photon génère un million d’électrons.

33 Impulsion de scatter: Jamais nulle. Impulsion de fluorescence élevée La fluorescence peut être nulle (=sous le seuil de détection) Temps de vol (microsec) Volts (0-10) LES IMPULSIONS LUMINEUSES SONT CONVERTIES EN IMPULSIONS ELECTRIQUES

34 Le cytomètre: quelques chiffres…. Sensibilité: moins de molécules fluorescentes par cellule. Soit moins de récepteurs antigéniques par cellule (un anticorps par récepteur et 3 molécules FITC par anticorps) Une cellule « positive » exprime en général de à quelques MILLIONS de récepteurs cibles. Une cellule négative émet une AUTOFLUORESCENCE naturelle équivalent à molécules FITC. Corollaire: une cellule déclarée « négative » peut en réalité exprimer un à plusieurs millier de récepteurs antigéniques, non détectés car situés sous le seuil de détection, ou sous le niveau d’autofluorescence naturelle. ==> La limite n ’est pas le cytomètre mais bien le matériel biologique. La sensibilité d’un cytomètre varie selon la nature des fluorochromes: Il sera plus sensible avec PE qui brille 40 x plus que FITC.

35 Photocathode Dynode Anode volts Un photon 10 6 électrons Tension PMT volts 0 10 Seuil (Threshold) Mesure Volts Amplification: Gain X1 à X16, Log Convertisseur Analogique => Digital 0 volts => canal volts => canal (ou 255) Le GAIN: Une amplification secondaire Linéaire ou logarithmique.

36 GAIN 2.5 GAIN 5.0 AMPLIFICATION LINEAIRE: LE GAIN S’UTILISE COMME UN ZOOM

37 Populations Hors échelle en Mode LIN

38 Le seuil de sensibilité: Souvent posé sur le scatter axial (FSC), il permet au cytomètre de ne PAS « voir » des particules trop petites. Le seuil ne peut jamais être mis à zéro: à vérifier si votre cytomètre semble « aveugle »

39 0 10 niveau de seuil Temps de vol (microsec.) 0 Amplitude mesurée 10 Volts 0 niveau de seuil Temps de vol (microsec.) 0 Amplitude mesurée 10 Volts FSC 10 Le niveau de seuil correctement ajusté permet de détecter, ou ignorer, des particules de taille donnée… PlaquettesLymphocytes

40 Presque toujours placé sur FSC, le seuil peut parfois être posé sur une fluorescence, par ex. 1)pour ignorer des cellules négatives majoritaires et repérer de rares cellules positives…par exemple pour les trier. Corollaire: vous ne pouvez plus calculer le % de cellules marquées, mais juste les repérer pour la pose d’une fenêtre de tri. 2)Pour ignorer les trop nombreux débris nucléaires à faible teneur en DNA (de fluo non nulle !!!) et focaliser l’analyse sur les rares vrais noyaux (de fluo supérieure)

41 Photocathode Dynode Anode volts Un photon 10 6 électrons Tension PMT volts 0 10 Seuil (Threshold) Mesure Volts Amplification: Gain X1 à X16, Log Convertisseur Analogique => Digital 0 volts => canal volts => canal (ou 255) Résumé: 1)PMT voltage, détermine l’amplification primaire de la fluorescence 2) Le GAIN, Amplification secondaire LIN (DNA) ou LOG (Immuno) Les scatters sont souvent LIN 3) Le SEUIL: Toujours utilisé en Scatter FSC; parfois (jamais) utilisé en fluorescence

42 0 10 Mesure Volts Convertisseur Analogique => Digital 0 volts => canal volts => canal (ou 255) Classement INTENSITE LUMINEUSE RELATIVE (Pas d’Unité ) NOMBRE De cellules CLASSEMENT DES DONNEES

43 1)Le cytomètre ne capture que de la lumière 2)Il sélectionne la couleur (longueur d’onde) grâce à des FILTRES Bleu = Scatters Vert, orange, rouge = Fluorescences 3) Il convertit l’INTENSITE lumineuse en COURANT électrique À l’aide d’une photodiode (Scatters) ou de Photomultiplicateurs (fluorescences) 4) Les signaux sont amplifiés à l’aide: du PMT voltage (uniquement fluorescences) du GAIN, LIN ou LOG (fluorescences et scatters) 5) La sensibilité du cytomètre est limitée aux particules de dimensions cellulaires par un SEUIL (uniquement FSC, en général) 7) Le cytomètre mesure l’amplitude des impulsions obtenues: !! cytomètre = voltmètre !! 8) Et classe le résultat sous forme numérique dans un fichier informatique (LIST MODE) 9) Les cellules à étudier sont sélectionnées par la pose graphique d’une fenêtre (« gate ») RESUME

44 1)Le cytomètre ne capture que de la lumière 2)Il sélectionne la couleur grâce à des FILTRES Bleu = Scatters Vert, orange, rouge = Fluorescences 3) Il convertit l’INTENSITE lumineuse en COURANT électrique À l’aide d’une photodiode (Scatters) ou de Photomultiplicateurs (fluorescences) 4) Les signaux sont amplifiés à l’aide: du PMT voltage (uniquement fluorescences) du GAIN, LIN ou LOG (fluorescences et scatters) 5) La sensibilité du cytomètre est limitée aux particules de dimensions cellulaires par un SEUIL (uniquement FSC, en général) 7) Le cytomètre mesure l’amplitude des impulsions obtenues. 8) Et classe le résultat sous forme numérique dans un fichier informatique 9) Les cellules à étudier sont sélectionnées par la pose graphique d’une fenêtre (« gate ») VOUS Intervenez à tous niveaux

45 CONCLUSION: le cytomètre donne TOUJOURS des résultats, quelque soit son état !!! C’est de VOUS, qui intervenez à de nombreux niveaux, que dépend la validité des mesures. NE PAS SE LAISSER GUIDER PAR DES AUTOMATISMES PREPROGRAMMES SANS LES AVOIR COMPRIS.

46 . Intensité relative MicroscopeCytomètre à flux : A B A B B A Faisceau laser largeFaisceau laser mince A B Le cytomètre et le microscope: difficultés d’interprétations

47 L’Analyse multicouleur: le problème des compensations dans le couple FITC - PE

48 . BP575/42 BP530/30 Longueur d'onde (nm) Fluorescence (intensité relative) FITC émet une fluorescence de prédominance verte à nos yeux, et majoritairement détectée par le PMT 1. En réalité, l'émission se poursuit dans le rouge et contamine le détecteur PMT2: On parle de "fuite optique" ou de "contamination optique" qui touche TOUS les détecteurs à des degrés divers: en général, PMT2 reçoit 25 à 35% du signal PMT1 PMT2 Le problème des fuites optiques: Les compensations de 2 couleurs

49 . BP575/42 BP530/30 Longueur d'onde (nm) Fluorescence (intensité relative) PE émet une fluorescence de prédominance orange à nos yeux, et majoritairement détectée par le PMT 2. En réalité, l'émission commence dans le jaune-vert et contamine le détecteur PMT1, et continue dans le rouge et contamine un PMT3 éventuel.... On parle de "fuite optique" ou de "contamination optique" qui touche TOUS les détecteurs à des degrés divers: en général, PMT1 reçoit moins de 2% du signal PMT2. PMT1PMT2

50 UVIR FL2= FL2-30%FL1FL1=FL1-2%FL2 La compensation électronique: Pour chaque cellule et chaque fluorescence on retranche la fraction contaminante que VOUS avez déterminée.

51 Pas de compensation Compensations optimales Trop compensé

52 PMT FL1= 900 V PMT FL2 = 550 V Disproportion des signaux:Compensation difficile ou impossible Plus de 70 % de contamination Mauvais !! Les PMT doivent être À un voltage plus ou moins Égaux.

53 CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX 1.ANALYSE 2.TRI CELLULAIRE 3.APPLICATIONS

54 Interception laser-flux: région d'analyse Formation des gouttes: région de tri Volts Volts Cellules triées Poubelle Plaques de charge: Barre d'obscuration Détecteur de diffusion axiale, FSC Détecteur de diffusion orthogonale, SSC

55 . Z Quartz Ao ro r Tri cellulaire: formation des gouttes

56 La longueur de la partie intacte du jet est fonction de l’AMPLITUDE de l’oscillation que VOUS donnez au qartz: elle doit être la plus courte possible, mais pas au point de déformer les « scatters » La distance qui sépare deux gouttes (=  ) Est fonction de la FREQUENCE de l’oscillation que VOUS donnez au qartz. AMPLITUDE et FREQUENCE

57 L’analyse d’une cellule ET la décision de tri se passent ici La même cellule sera enfermée dans une goutte qui se forme PLUS TARD: La charge de la goutte se fera ici DELAI DE CHARGE d’une goutte = Le temps que met une cellule pour aller du point d’analyse à la formation de la goutte LE DELAI DE CHARGE: définition 110 microsecondes séparent l’analyse du tri: C’est le temps que doit attendre le cytomètre entre analyse et tri d’une cellule donnée. La procédure est séquentielle, et non simultanée: pour chaque cellule il y a analyse et ensuite tri

58 0,25 mm Sommet du gicleur Impact laser Distance 'D' mesurée Distance 'D' reportée ==> Délai de charge = temps de formation de gouttes Goutte n°1 Lien ESTIMATION DU DELAI DE CHARGE

59 La position d’une cellule dans le flux est incertaine Pour cette raison, on dévie un TRAIN de 3 gouttes successives pour chaque cellule triée: 1) la probabilité que la cellule désirée soit présente dans l’une des gouttes du train est très grande. 2) La probabilité qu’il y ait plus d’une cellule par train est faible mais n’est pas nulle: c’est une coïncidence qu’il faudra détecter et rejeter du tri.

60 L’onde de charge (A) et l’onde de fragmentation du flux (B) sont physiquement indépendantes: elles DOIVENT être mises en phase afin que chaque goutte soit correctement chargée puis déviée.

61 Gicleur Champ électrique 3 jets cohérents: phase correcte Multitude de jets: déphasage important Flux

62 Goutte principale Goute satellite Satellite lent… …rattrapé par La goutte principale Temps 1 Temps 2

63 ps 0 Temps 1: Satellite lent Temps 1: Satellite rapide Lien Charge négative Charge nulleCharge nulle 1 1 C A B Satellite lent rattrapé par la goutte suivante

64 A B C D E 3 THYMUS DE SOURIS ADULTE: TRI DES 4 SOUS-POPULATIONS DE CELLULES T TRI DE MASSE: ON RECOLTE UN MAXIMUM DE CELLULES

65 Clones Lignée MP Lyt-2 (CD8) L3T4 (CD4) CLONAGE DE CELLULES PAR CYTOMETRIE EN FLUX:

66 Le clonage démontre que la cytométrie en flux est une méthode -Non destructive, la cellule est intacte et reste en vie … -Propre, les conditions d’aseptie peuvent être réunies….

67 Temps mort et coïncidences Temps mort du cytomètre: temps minimal incompressible, nécessaire à la détection, l’analyse et le tri d’UNE cellule Durant ce temps, le cytomètre est exclusivement consacré à ces tâches: Le traitement de LA cellule en cours. Si une seconde cellule arrive dans le cytomètre déjà occupé à traiter une première cellule, cette seconde cellule est dite « en coincidence ». La cellule en coincidence peut être détectée mais pas analysée (ni triée), ou même peut ne pas être vue du tout !!! Certaines coincidences sont détectables et bien gérées par le cytomètre qui rejettera du tri l’ensemble des cellules concernées: cas du train de gouttes à plus d’une cellule.

68 Tout OK Coïncidence d’analyse Coïncidence de tri Agrégat: erreur Coïncidences: Certaines cellules sont détectées mais pas analysées ou analysées mais pas triées… Ou ne sont JAMAIS VUES !!!

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71 TRI DE CELLULES RARES: CONTRÔLE DE QUALITE 1%>99 %

72 CYTOMETRIE EN FLUX: PRINCIPES FONDAMENTAUX 1.ANALYSE 2.TRI CELLULAIRE 3.APPLICATIONS

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77 Cytométrie à 3 couleurs: Double phénotype corrélé au DNA CD4 CD8 DNA 00

78 3 antigènes, 3 anticorps. R-PE FITC Biotine (Strept)-Avidine Texas Red™ ou Cyanines-5 Cellule LASER TRANSFERT D'ENERGIE FLUORESCENCE VERTE, 520 nm FLUORESCENCE ORANGE, 575 nm FLUORESCENCE ROUGE, >620 nm

79 Triple immunophénotype: Le diagramme de dispersion 3-D

80 (nm) l FITCR-PER-PE*TRAPCPerCP 100 Excitation: Emission: UNE COMBINAISON POSSIBLE D'ANALYSE SIMULTANEE DE 5 FLUORESCENCES PAR CYTOMETRIE EN FLUX - NECESSITE DE 2 LASERS.

81 FLUX LASER #2 LASER #1 FSC SSC APC FITC LE CYTOMETRE A DEUX LASERS

82 Flux Laser 1: 488 nm Laser 2: 647 nm MD 560 LP MD 610 LP MD 90/10 1/2 miroir BP 530/30 Fluo-3 / Fitc BP 575/30 R-PE BP 670/14 APC BP 675/20 PerCP BP 488/10 SSC BP 488/10 FSC Deux fluorescences similaires (APC et PerCP) sont spatio-temporellement séparées dans un cytomètre bi-lasers.

83 Laser 1 Laser Microsecondes FSC FL1 FL2 Time-gating: le signal FL2 du laser 2 est séparé Spatio-temporellement des signaux FSC-FL1 du laser 1

84 Laser 1 Laser Microsecondes FSC FL1 FL2 Time-gating: conséquence : APC de meme couleur de fluorescence que PerCP est néanmoins distinctement analysé car 20 microsecondes séparent les deux émissions ET que 0,25 mm séparent les deux impacts lasers sur le flux. PerCP APC

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86 Fluo-3/AM liposoluble incapable de fixerCa 2+ Fluo-3/AM séquestration Mitochondries, RE. Estérases cellulaires Fluo-3 hydrosoluble, fluorescence faible [Ca 2+ ] i Fluo-3-[Ca 2+ ] i fluorescence multipliée, X40 Fuites [Ca 2+ ] o

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88 Les flux calciques

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