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ECUE Méthodologie de la Génétique Moléculaire Mise en évidence et cribles basés sur des interactions protéiques Cribles basés sur des critères d’expression.

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1 ECUE Méthodologie de la Génétique Moléculaire Mise en évidence et cribles basés sur des interactions protéiques Cribles basés sur des critères d’expression différentielle Mutagenèse insertionelle chez la drosophile transgenèse Vecteurs Mutagenèse Perte et gain de fonction Cours sur le FRET Maïté Coppey : 12/10 Cours sur la PCR quantitative Thierry Grange 19/10 TD : Claire Darzac TD : Sandrine Caburet TD : Alain Zider

2 Mise en évidence d’interactions protéiques par des méthodes biochimiques Test d’interaction GST Co-immunoprécipitation Cribles permettant d’identifier des partenaires protéiques Criblage d’une banque d’expression dans lambda GT11 Clonage de molécules de surface par expression transitoire Le système double hybride Le phage display Protéomique et interaction protéique

3 GSTX plac Culture de bactéries Extraction protéique Lysat bactérien Analyse sur gel SDS page M marquage métabolique produit de transcription traduction rinçages

4 GSTX plac Culture de bactéries Extraction protéique GST plac rinçages Analyse sur gel SDS PAGE

5

6 M X Y Ig Mise en évidence Y Coloration à l’argent Anticorps anti Y Marquage métabolique methionine 35 S Cartographie peptidique par spectrométrie de masse Co-immunoprécipitation Extrait cellulaire Anticorps anti X Protéine A sépharose Dénaturation et analyse sur gel SDS page

7 Criblage d’une banque d’expression dans GT11

8

9 banque de cDNA construite dans un vecteur d’expression eucaryote Cellules cos Expression transitoire Incubation avec un premier anticorps isolement de l’ADN épisomal Transfection dans des bactéries Analyse des cDNA (séquençage) étalement

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11

12 Lex op LexA Gal4 AD LacZ

13 DLAApat PolyA Prom. ampiciline trp 2µ Ori coli LexA DLA gal4 DATProie PolyA Prom. ampiciline leu 2µ Ori coli DAT Gal4 VP16 B42 Rapporteur PolyA ampiciline His 2µ Ori coli lacZ met DLA Apat DAT Proie

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15 stratégie de contre sélection

16 5’ fluoroorotic acid 5’ fluorodexoxyuridineThymidilate synthase DNA synthesis

17 Mise en évidence d’une interaction Protéine ARN (phage MS2) Apat ARN phage MS2

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20 Transformation dans E.Coli (sup ambre) Phage rescue purification des phages et passage sur colonne d'affinité Ré-infection de bactéries et isolement des plasmides rinçages élution

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27 Co-Immunoprécipitation

28 RNA biotinylésSpliceosome humain Analyse en gel bidimensionnel Identification par Spectrométrie de masse Isolement du cDNA correspondant Expression d’une protéine chimère 41-GFP 41-GFP Anti corps anti - U1-snRNP Transfection dans des celllules HeLa


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