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LE SEQUENCAGE. OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE  QUALITE DE LA MATRICE - Produit de PCR : Purification (élimination des amorces,

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1 LE SEQUENCAGE

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9 OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE  QUALITE DE LA MATRICE - Produit de PCR : Purification (élimination des amorces, dNTP) - Kit de purification ( colonnes Qiagen – Sigma …) - Traitement à l’ExoSAP Mélange de 2 enzymes : Exonucléase 1 (élimine les amorces) Phosphatase Alcaline (élimine les dNTP) - Plasmide : Purification - Kit de purification - Quantification - Dépôt sur gel d’agarose avec marqueur de taille - Nanodrop

10 OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE  REACTION DE SEQUENCE - Instructions du fournisseur - Quantité d’ADN - Volume du mélange réactionnel - Quantité d’amorce - Cycles 94°C 3 min (96°C 10sec- 50°C 5 sec - 60°C 4 min) 25x Volume total = 25 µl ADN (PCR) = 5 ng Amorce = 3 pmoles Tampon 5X = 2,5 µl Kit Big Dye = 1 µl H 2 O = qsp 25 µl Kit Big Dye contient : - ADN Polymérase - Tampon - MgCl 2 - dNTP - ddNTP*

11 OPTIMISATION DE LA RÉACTION DE SEQUENCE  PRECIPITATION DES SEQUENCES - Instructions du fournisseur - Précipitation éthanolique NaAc 3M pH 4,6 + EtOH 95% Lavage EtOH 70% - Purification sur billes magnétiques (Agencourt)

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13 SEQUENCEUR CAPILLAIRE

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18 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

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24 POURQUOI ANALYSER UNE SEQUENCE ? - A partir de la structure d’un gène, déterminer la séquence codante et en déduire la séquence protéique - Trouver des homologies : - Au niveau des gènes d’une même famille - Au niveau d’un même gène dans différentes espèces - Trouver des différences : - Polymorphismes - Mutations  Alignement de séquences (Logiciel SeqScape)

25 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQSCAPE

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28 EXON 9 Homozygote A/A Homozygote G/G Hétérozygote A/G

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30 Exemple de séquence avec intensité de fluorescence saturante en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié (onglet Raw, ne pas dépasser 4000 en intensité) 16 et 17/02/2005 : 190_1L

31 Exemple de séquence avec intensités de fluorescence saturantes Même tube de séquence : en haut, temps d’injection standard ; en bas, temps d’injection diminué de moitié 16 et 17/02/2005 : 190_1L

32 Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3 Run 633, 191_13 et 31_13R

33 Exemple de séquence avec amorce partiellement dégradée : n-1, n-2, n-3 Run 633, 191_13 et 31_13R

34 Exemple de séquence à partir d’un produit PCR contaminé par les amorces PCR : superposition des séquences sens et antisens.

35 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS - Mutation Faux-Sens  Modifie l’acide aminé - Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé - Vérifier si la classe de l’acide aminé change - Mutation Non Sens  L’acide aminé est remplacé par un Stop - Stop prématuré  production d’une protéine tronquée - Mutation d’épissage - Au niveau du site donneur - Au niveau du site accepteur - Insertion/Délétion  Décalage du cadre de lecture - Stop prématuré  production d’une protéine tronquée - Mutation silencieuse  Ne modifie pas l’acide aminé - Mutation intronique

36 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation Faux-Sens ATA  GTA (Ile  Val) c.1336A>G p.I446V

37 CGA  TGA (Arg  Stop) c.2587C>T p.R863X Production d’une protéine tronquée LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation Non Sens

38 Délétion de 2 pb : c.1790_1delTT p.Phe597CysfsX23 Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCT Séquence mutée TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT Séquence normale : TCA GCA GAC TTT GTG GTG GAG GCT ATC GGG GAC GAC GTG GGC Séquence mutée : TCA GCA GAC TGT GGT GGA GGC TAT CGG GGA CGA CGT GGG CAC GCT GGG CTT CTC GGT GGA AGG GCC ATC GCA GGC TAA LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Délétion/Insertion

39 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation d’épissage Intron 12 - c T>G

40 EXON INTRON %A %T %C %G A G G T A A G T SEQUENCE CONSENSUS DU SITE DONNEUR D’EPISSAGE

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44 Exon 9 Exon 10Exon 11 AG GT Exon 9 Exon 10Exon 11 CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE Exon 9 Exon 10Exon 11 AG GT Exon 9 Exon 10Exon 11

45 LOGICIELS D’ANALYSE : SEQUENCE NAVIGATOR - Mise en évidence de mutations A  G Modification du site accepteur d’épissage

46 INTRON EXON %A %T %C %G Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y N Y A G G Polypyrimidine track (Y = T ou C; N = n’importe quelle base) SEQUENCE CONSENSUS DU SITE ACCEPTEUR D’EPISSAGE

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49 Exon 9 Exon 10Exon 11 AG GT Exon 9 Exon 10Exon 11 AG Exon 9 Exon 10Exon 11 GT AGGT Exon 9 Exon 11 CONSEQUENCES D’UNE MUTATION D’EPISSAGE AG Exon 9 Exon 11 Exon 9 Exon 10

50 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation silencieuse Exon 2 – c.111G>A p.Thr37Thr Homozygote G/G Hétérozygote G/AHomozygote A/A

51 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS Mutation intronique Homozygote T/T Hétérozygote T/C Homozygote C/C Intron 2 – c.83-29G>A

52 LES DIFFERENTS TYPES DE MUTATIONS -Vérifier la présence de la mutation chez les parents du malade et d’autres membres de la famille - Mutation Faux-Sens - Vérifier s’il s’agit d’un acide aminé conservé - Vérifier si la classe de l’acide aminé change - Mutation Non Sens - Stop prématuré  production d’une protéine tronquée - Vérification par Western Blot - Mutation d’épissage - Vérification par RT-PCR - Insertion/Délétion  Décalage du cadre de lecture - Stop prématuré  production d’une protéine tronquée - Vérification par Western Blot - Mutation silencieuse ou intronique - Vérifier s’il s’agit d’un polymorphisme - Répertorié dans les banques de données - Tester 50 à 100 individus contrôle

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54 Exon 9 Exon 10Exon 11 AG GT Exon 9 Exon 11 Exon 9 Exon 11 Exon 9 Exon 10 Exon 11 Exon 9 Exon 10Exon pb 150 pb ??? 250 N Ht Hm 250 ???

55 Exon 9 Exon 10Exon 11 AG GT Exon 9 Exon 10Exon pb 150 pb Exon 9 Exon 10Exon N Ht Hm 250 ???

56 ANALYSE DE MARQUEURS MICROSATELLITES LOGICIEL GENEMAPPER

57 Marqueur Microsatellite : Segment d’ADN contenant des répétitions en tandem de courts motifs de 2,3 ou 4 nucléotides. Très nombreux, dispersés sur tout le génome, ils sont le siège de variations à l’origine de polymorphismes multialléliques très informatifs

58  Analyse de marqueurs microsatellites - PCR : une des amorces marquée par un fluorochrome (6FAM) - Produit de PCR fluorescent - Mélange du produit avec un marqueur de taille (35 à 350 pb) marqué par un autre fluorochrome - Séparation des fragments sur séquenceur capillaire - Détection des fragments fluorescents - Analyse des données LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER

59 Exemple : - Mise en évidence d’une délétion sur le chromosome 11 chez un patient par FISH - Déterminer les bornes de la délétion par analyse des marqueurs microsatellites de la région - Choix de 5 marqueurs - Réalisation des PCR sur l’ADN du patient et de ses parents - Séparation des fragments sur séquenceur capillaire - Analyse par GeneMapper D11S4135 D11S4147 D11S1354 D11S1795 AP AP AP AP AC AP AP AP AP AP D11S873 D11S1775 D11S4187 D11S1306 AP AP AP AP AP AP AP CT

60 D11S4187

61 D11S1775

62 D11S873

63 D11S4135

64 D11S4147

65  Exemple d’analyse de marqueurs microsatellites - Mise en évidence d’une microdélétion d’origine paternelle Cen D11S4187 D11S1775 D11S873 D11S4135 D11S4147 Tél PM D LOGICIELS D’ANALYSE : GENE MAPPER

66 D11S4135 D11S4147 D11S1354 D11S1795 AP AP AP AP AC AP AP AP AP AP D11S873 D11S1775 D11S4187 D11S1306 AP AP AP AP AP AP AP CT Non Del Del Non Inf D11S D11S 4135 est délété - Tester D11S1795, D11S1354 et/ou D11S1979 pour déterminer la borne télomérique


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