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Automatisation du marquage des ADN pour l’Analyse Chromosomique sur Puces à ADN (ACPA): validation de la station BRAVO au CHU de Lyon. Lyon le 10 Septembre.

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1 Automatisation du marquage des ADN pour l’Analyse Chromosomique sur Puces à ADN (ACPA): validation de la station BRAVO au CHU de Lyon. Lyon le 10 Septembre Jessica MICHEL Laboratoire de Cytogénétique Constitutionnelle Groupement Hospitalier Est du CHU de Lyon

2 2 La plateforme ACPA de Lyon Lyon le 10 Septembre 2014 Depuis 2007 Déficiences intellectuelles isolées/syndromiques et syndromes malformatifs Depuis 2011 Troubles du spectre autistique Depuis 2013 Syndromes polymalformatifs en prénatal

3 3Lyon le 10 Septembre 2014 La plateforme ACPA de Lyon

4 Nécessité d’automatisation Extraction ADN: Hamilton (en cours de validation) -> utilisation début 2015 Technique ACPA : BRAVO Agilent Interprétation résultats: - Agilent Cytogenomics - Cartagenia 4Lyon le 10 Septembre 2014 La plateforme ACPA de Lyon

5 5 Dosage ADN : Nanodrop 1000® / Qubit® ACPA : - Four à hybridation - Scanner Agilent - Caisson ozone free Lyon le 10 Septembre 2014

6  Préparation des ADN et pipetage  Peut traiter 48 patients en simultané Améliorations attendues:  Gain de temps.  Reproductibilité de la technique.  Qualité des résultats.  Risque d’erreur réduit.  Traçabilité. 6Lyon le 10 Septembre 2014 Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform

7 Douchette codes à barres Thermocycleur Scelleuse Thermique ( + films thermosensibles) Centrifugeuse compatible avec les plaques PCR 96 puits Lyon le 10 Septembre Appareillages spécifiques 2 « Racks » pour microtubes 1.5mL

8 Pour une série de 48 patients 8 Consommables spécifiques 1 plaque purification 5 Boites 96 pointes 250µL (Tips) 1 plaque « deep well 384 puits» réutilisable 1 seule fois 1 plaque « réservoir » réutilisable 1 plaque « poubelle » réutilisable Films protecteurs 3 Plaques PCR 96 puits

9 Avant passage sur le BRAVO Lyon le 10 Septembre Préparation d’une technique

10 Nous indiquons le nom, le prénom, notre n° SGL, concentration ADN Lyon le 10 Septembre

11 Création automatique des plans de dépôt Lyon le 10 Septembre

12 Création automatique du fichier pour le BRAVO Format csv Lyon le 10 Septembre

13 Création automatique des étiquettes pour les tubes « finaux » (ADN marqués et combinés en « dye-swap ») Lyon le 10 Septembre

14 Création automatique de l’attributefile pour Cytogenomics Lyon le 10 Septembre

15 Patient A Patient B Patient D Patient C Cy5 Cy3 Image en miroir Quatuor Adaptation du protocole BRAVO. del(13)(q33.1) et dup(13)(q33.1q34) 15Lyon le 10 Septembre 2014 ACPA : Technique en « Dye-Swap »

16 Etape 1 : Dilution des ADN (1µg d’ADN/par patient/couleur) Etape 2 : Digestion des ADN (enzymes de restriction) Etape 3 : Marquage des ADN (Cyanine 5 / Cyanine 3) Etape 4 : Purification des ADN marqués sur plaques Etape 5 : Combinaison des ADN / Re-tube Etape 6 : Dosage des fluorochromes Etape 7 : Hybridation des ADN combinés sur lame Etape 8 : Lavage des lames – lecture scanner Etape 9 : Traitement informatique des données. Etapes automatisées par le BRAVO Lyon le 10 Septembre Application du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon

17 Lyon le 10 Septembre Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon Etape 1 : Dilution des ADN (1µg d’ADN/par patient/couleur) Etape 2 : Digestion des ADN (enzymes de restriction) Etape 3 : Marquage des ADN (Cyanine 5 / Cyanine 3) Etape 4 : Purification des ADN marqués sur plaques Etape 5 : Combinaison des ADN / Re-tube Etape 6 : Dosage des fluorochromes Etape 7 : Hybridation des ADN combinés sur lame Etape 8 : Lavage des lames – lecture scanner Etape 9 : Traitement informatique des données. Etapes automatisées par le BRAVO Etapes manuelles

18 Essais sur 24 patients (soit 6 Quatuors):  Test 1 : Vérifications d’anomalies connues  Test 2 : Technique automatisée VS Technique manuelle  Test 3: Patient commun à trois quatuors -> reproductibilité des résultats.  Test 4: Self-Self.  Test 5: ADN issus de 4 tissus de types différents. Problèmes initiaux rencontrés:  Programmation : plan de dépôt  Normalisation : volume d’eau prévu erroné -> rajout d’eau au cours de processus  Mix marquage : protocole « CGH/SNP enzymatic » -> rajout de mix manuellement en cours de processus  Re-tube : tout l’ADN marqué n’est pas récupéré à la fin de la technique (1/3) Lyon le 10 Septembre Validation : Premiers essais

19 Patient A (technique manuelle du ) DLRS 0.13 / 0.15 del(17)(p11.2p11.2) de 4.7Mb de 15,786,351 à 20,515,050pb (hg19) Patient A (BRAVO le ) DLRS 0.20 / 0.20 del(17)(p11.2p11.2) de 4.7Mb de 15,786,351 à 20,515,050pb (hg19) Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1) Patient A grand CNV pathogène Patient B dérivé de translocation Patient C petit CNV pathogène Patient D grand CNV en mosaïque Lyon le 10 Septembre Manuel BRAVO

20 Patient B (technique manuelle du ) DLRS 0.12 / 0.12 del(17)(p13.3) de 1,5Mb de 51,885 à 1,564,729pb (hg19) dup(19)(q13.41p13.43) de 1,5Mb de 52,457,742 à 59,092,570pb (hg19 ) Patient B (BRAVO le ) DLRS 0.28 / 0.20 del(17)(p13.3) de 1,5Mb de 51,885 à 1,564,729pb (hg19) dup(19)(q13.41p13.43) de 1,5Mb de 52,457,742 à 59,092,570pb (hg19 ) Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1) Patient A grand CNV pathogène Patient B dérivé de translocation Patient C petit CNV pathogène Patient D grand CNV en mosaïque Manuel BRAVO Lyon le 10 Septembre

21 Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1) Patient A grand CNV pathogène Patient B dérivé de translocation Patient C petit CNV pathogène Patient D grand CNV en mosaïque Patient C (technique manuelle du ) DLRS 0.16 / 0.16 del(X)(q26.3) de 40.7kb de 135,080,988 à 135,121,564pb (hg19) Patient C (BRAVO le ) DLRS 0.20 / 0.28 del(X)(q26.3) de 40.7kb de 135,080,988 à 135,121,564pb (hg19) Lyon le 10 Septembre Manuel BRAVO

22 Test 1 : Vérifications d’anomalies connues (Quatuor 1) Patient A grand CNV pathogène Patient B dérivé de translocation Patient C petit CNV pathogène Patient D grand CNV en mosaïque Patient D (technique manuelle du ) DLRS 0.12 / 0.15 Dup(19)(p13.12-p12) de 8.3Mb de 15,987,511 à 24,340,741pb (hg19) en mosaïque à 58% Patient D (BRAVO le ) DLRS 0.20 / 0.20 Dup(19)(p13.12-p12) de 8.3Mb de 15,987,511 à 24,340,741pb (hg19) en mosaïque à 44% Test 1: Toutes les CNV pathogènes ont été retrouvés à l’oligo prêt. 22 Manuel BRAVO Lyon le 10 Septembre 2014

23 Test 2 : (Quatuor 2) : Technique automatisée VS Technique Manuelle Qualité de la technique BRAVO dépendant des problèmes techniques rencontrés. Patient G : Technique ManuellePatient G : BRAVO Test 2 : Test à refaire Lyon le 10 Septembre Manuel BRAVO

24 Test 3 : un patient (Quatuors 2 – 3 – 4) Patient E analysé 3 fois dans 3 quatuors différents (contre de nouveaux patients/témoins à chaque fois: patients F à N.) Technique réalisée le même jour, en même temps -> Lames hybridées à des dates ultérieurs différentes. Quatuor 1 DLRS 0.23/0.19 Quatuor 2 DLRS 0.26/0.20 Quatuor 3 DLRS 0.21/0.22 Test 3 : Test validé, les mêmes CNV sont retenus Lyon le 10 Septembre

25 Test 4: Self-self : Patient O Cy5 / Patient O Cy3 La « moving average » reste centrée sur le log²=0 DLRS : 0.20 Interval Based Report : 0 CNV Lyon le 10 Septembre

26 Test 5 : Analyse d’ADNs issus de différents prélèvements. (Quatuor 6) Patient R Tissu congelé Patient S Sang (technique classique avec 2mL de sang) Patient T Liquide Amniotique (CBC : culture) Patient U Sang (quantité sang>2mL) Technique manuelle du Patient R Cy5 / Témoin Tissu Cy3 DLRS 0.15 del(4)(q32.2) de 258kb allant de 164,758,325 à 165,015,998pb (hg19) Technique BRAVO le Patient R Cy5 / Patient UCy3 DLRS 0.22 Patient S Cy5 / Patient R Cy3 DLRS 0.18 del(4)(q32.2) de 258kb allant de 164,758,325 à 165,015,998pb (hg19) Lyon le 10 Septembre Manuel BRAVO

27 Test 5 : Analyse d’ADNs issus de différents prélèvements. (Quatuor 6) Patient R Tissu congelé Patient S Sang (technique classique avec 2mL de sang) Patient T Liquide Amniotique (CBC : Culture) Patient U Sang (quantité sang>2mL) Technique BRAVO le Patient T Cy5 / Patient S Cy3 DLRS 0.21 IBR 27 CNVs Patient U Cy5 / Patient T Cy3 DLRS 0.30 IBR 26 CNVs Lecture visuelle : 10 CNV retenus Technique manuelle du Patient T Cy5 / Témoin Cy3 DLRS 0.27 IBR 25 Lecture visuelle : 9 CNV retenus 27 Manuel BRAVO Lyon le 10 Septembre 2014 Test 5 : Technique adaptable sur tissus spéciaux -> quantité d’ADN (Volume mini Bravo)

28 1 Janvier-Février : 2 Séries de 24 patients Evènements et modifications du protocole  Tests « à blanc » : heurt entre le bras de l’appareil et la « deep well 384 » -> 3 « têtes préleveuses » cassées à changer -> adaptation au consommable « deep well 384 » achetée (Marché HCL)  Installation caisson -> décalage de la tête du Bravo  Répartition mix de digestion : pas de mix dans 2 colonnes -> 2/6 Quatuors non marqués à refaire  Intervention Agilent -> re-paramétrage des axes -> affiner le réglage de la hauteur 28Lyon le 10 Septembre 2014 Premières séries de patients Premières série : améliorations apportées -> Tester « à blanc » toutes les étapes -> 2 quatuors à refaire

29 Lyon le 10 Septembre Mars : Séries de 24 patients Premières séries de patients Lectures (visuelles): Patient 1 : 12 CNVs Patient 2 : 16 CNVs Patient 3 : 16 CNVs Patient 4 : 11 CNVs Patient 5 : 11 CNVs Patient 6 : 11 CNVs Patient 7 : 12 CNVs Patient 8 : 14 CNVs

30 Troisième série : 6 quatuors validés Lyon le 10 Septembre Mars : Séries de 24 patients Premières séries de patients  Résultats corrects: 0,15 problèmes de volumes  Intervention Agilent

31 Lyon le 10 Septembre Validation de méthodes  Série de 24 patients dont 12 patients avec anomalie connue Chaque Quatuor = 2 anciens patients + 2 nouveaux patients Toutes les anomalies connues ont été retrouvées. Validation technique du Bravo (sur 24 patients)

32  Tests « à blanc » : Digestion – Marquage – Combinaison – Retube ( étapes ayant subi des changements)  Normalisation erronée -> blocage à 23/48 patients. -> intérêt de tester « à blanc » toutes les étapes avec le véritable nombre de patients.  Installation du nouveau protocole « normalisation ».  Problème de format du fichier « feuille de route » -> caractères spéciaux.  Plaque PCR défectueuse / Echec technique  Intervention Agilent Lyon le 10 Septembre Mars : Série de 48 patients Suite séries de patients 1 Série de 48 patients perdue. -> passage à 48 patients pas encore possible.

33 Lyon le 10 Septembre Suite séries de patients Mai – Juin – Juillet Problèmes à résoudre  Programmation -> Bulles -> Répartition mix digestion : inégale -> rajout manuel -> Déplacement du bras  Gestion des erreurs -> Problème position des « Tips »  Intervention Agilent Série de 48 patients validée suite à l’intervention d’Agilent Depuis juillet : 2 séries de 48 sans problème : Passage en routine

34 Temps gagné BRAVO (48 patients) EtapesManuelle (8 patients) 1H Préparation (feuille de route, ADNs, …) 30 min 3HNormalisation (+ Split TipBox) 45 min 30 minDigestion 2HMarquage30 min 2HPurification1 H 30 1HCombinaison et Re-tube10 min ≈ 12 min / patient≈ 25 min / patient Lyon le 10 Septembre Evaluation du temps technique

35 AvantagesLimites  Vitesse -> tps technique/patient réduit  Reproductibilité -> démarche qualité  Qualité des résultats  Réactivité du support technique  Traçabilité (réactifs et patients) -> démarche qualité  Préparation en amont -> 48 dossiers  Tests « à blanc » obligatoires  Applicable pour 4x180K pour l’instant  Volume d’ADN mini (+5µL) et microtubes compatibles avec « Racks » -> aliquots reçus extraits/échantillons précieux  Formation logiciel et problèmes informatiques  Consommables (quantité, colonnes de purifications non utilisées) Lyon le 10 Septembre Avantages / Limites de la technique

36  Réorganisation du service -> 1 technicien/Bravo -> hybridations « en série » par autres techniciens.  Tests « à blanc » sur toutes les étapes et pour chaque programme (nombre patients – formats lames)-> après chaque modification -> temps + consommables Perspectives :  Automatisation plus globale du processus « ACPA »: -Extraction ADN -Passage à Cytogenomics -> possibilité d’autoprocessing  Refaire quelques tests-> « Validation des méthodes » -> Accréditation  ACPA en acquis : ADN patients / ADN Témoin -> reprogrammation  Intervention Agilent Lyon le 10 Septembre Conclusions et perspectives

37 Remerciements ACPA Damien Sanlaville Marianne Till Audrey Labalme Nicolas Chatron Caroline Schluth Eudeline Alix Chantal Beche Christelle Angei Laurence Caine Hélène Guilbert Isabelle Morin Clément Bonnefille Cassandra Nivou Jessica Michel Laboratoire Caroline Perbet Emmanuelle Banquart Christine Bel Anne Fautrelle Catherine Hempel Brigitte Jelassi Sylvie Josué Chantal Lavert Michelle Martin Christine Valex Corinne Buis Azim Rafat Patrick Edery Réseau AChroPuce Lyon le 10 Septembre Automatisation du marquage des ADN pour l’Analyse Chromosomique sur Puces à ADN (ACPA): validation de la station BRAVO au CHU de Lyon. Support Agilent

38 Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000  En manuel Avec Bravo Cyanine 5 Concentration ADN Cy5 Quantité fluorochrome Cyanine 3 Concentration ADN Cy3 Quantité fluorochrome Cyanine 5 / Cyanine 3 Concentration ADN Cy5 / Cy3 Quantité fluorochromes combinés Dilution car volume 2X plus grand. Bruit de fond Cy3 dans Cy5. Lyon le 10 Septembre Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon

39 En manuel 39 Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000 

40 En manuel 40 Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000 

41 Avec Bravo 41 Adaptation du protocole Bravo à l’ACPA pour Lyon Dosage des Cyanines au Spectrophotomètre Nanodrop1000 

42 ModificationsConséquences  Digestion – Marquage : Possibilité d’introduire un « STOP » entre la digestion et le marquage  Répartir la technique sur plusieurs jours  Digestion : Suppression de l’étape de transfert de la plaque « ADN normalisés » vers une 2 nde plaque « digestion »  Gain de temps  Gain de quantité d’ADN  Economie de consommables  Re-tube : Récupérer tout l’ADN marqué/combiné  Gain de quantité d’ADN marqué  Etape de concentration « speedvacc » supplémentaire Lyon le 10 Septembre Modifications supplémentaires demandées


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