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Bacterial adhesion probed at the molecular scale Bernard Bourguignon Henri Dubost Marie-Pierre Fontaine-Aupart Marie-Noëlle Bellon-Fontaine Jean-Marie.

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1 Bacterial adhesion probed at the molecular scale Bernard Bourguignon Henri Dubost Marie-Pierre Fontaine-Aupart Marie-Noëlle Bellon-Fontaine Jean-Marie Herry Romain Briandet Bulard Emilie 2 ème année de thèse Hydrophobic Hydrophilic bacteria

2 Outline 1 – Introduction 2 – The Sum Frequency Generation Spectroscopy SFG 3 – Bacterial adhesion 4 – Results 5 – Conclusion and prospects

3 Aim of the study Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects Bacterial biofilm : a public health problem… Method : SFG spectroscopy on self-assembled monolayers

4 Some theory… Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects Sample to analyse IR SFG Ep IR The femtosecond vibrational SFG technique : Interest : Centro-symmetric objects give no SFG signal. Spectroscopy well-adapted to ordered interface Non linear medium Visible SFG ω (cm -1 )

5 SFG on the ODT SAM Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects The choosen support : the OctaDécaneThiol (ODT SAM) 7 elongation vibrations to take into account : - CH 3 symmetric and asymmetric - Fermi resonance of CH 3 - symmetric and asymmetric of CH 2 near CH 3 - symmetric and asymmetric of CH 2 near S Experimental : - visible beam at 800 nm - IR beam at 3 µm (obtained with an OPA) CH 3 S SS S Au i X Bourguignon et al. Surface Science 2008; 602:

6 Bacteria Lactococcus lactis adhesion on the solid Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects Model bacteria : Lactococcus lactis bacteria ; hydrophilic 1 and its hydrophobic 2 mutants, no pathogens with ovococoïd forms MEB image, 3 x 2.25 µm 2, INRA Visible IR Sum Frequency CaF2 Or Air ODT SAM Bacteria in water Bacterial suspension (10 9 bactéries/mL) in water or KNO 3 (10 -1 M) Washing with solvent 1h30 adhesion ODT/Au Adhesion : SFG analyse 1 Kulakauskas et al. Journal of biological chemistry 2009; 285:14 2 Briandet et al. Microbiology 2007; 7:36 Epifluorescence image, 50x50 µm 2

7 SFG spectrum on the ODT SAM in the air Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects SFG ω (cm -1 ) Sym CH 3 Asym CH 3 Fermi CH 3 Profil spectral de l’IR (mesuré sur GaAs) Spectre SFG expérimental Spectre modélisé sous mathematica Résultat de la déconvolution I(ω SFG ) α g(ω IR ) χ NR exp(iφ)+ Σ AnAn n ω IR - ω n +iГ 2 Deconvolution of spectra : R parameter : R = Symmetric signal of CH 3 Asymmetric signal of CH 3 R (air) = 4

8 Bacterial adhesion effect on the ODT SAM Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects SFG ODT in water R (eau) = 5.8 ω (cm -1 ) SFG ω (cm -1 ) ODT + hydrophilic bacteria in water ODT + hydrophobic bacteria in water R (hydrophilic bacteria) = 8.8 R (hydrophobic bacteria) = 3.8 Bacterial recovery : 70 % SFG ω (cm -1 ) Air ω (cm -1 ) SFG Water

9 Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects Signification of R parameter : Linked to the ODT SAM conformation c (axe C 3 ) μaμa μaμa μsμs S Au E a b c (axe C 3 ) μaμa μaμa S Au μsμs E Raising terminal CH 3 M SFG α µ.E µ s : dipolar moment of CH 3 symmetric vibration µ a : dipolar moment of CH 3 asymmetric vibration R = Symmetric signal of CH 3 Asymmetric signal of CH 3 R increases Bacterial adhesion effect : Bactérie hydrophobeBactérie hydrophile S Air S S S S O H H O H H O H H SS S S S S S Φ = 244° Θ méthyl = 54° Φ = 250° Θ méthyl = 52.5° Φ = 260° Θ méthyl = 48.9° Φ = 238° Θ méthyl =56.6° Bacterial adhesion effect on the ODT SAM

10 Conclusion and prospects Introduction The SFG technique Bacterial adhesion Results Conclusion and prospects SFG spectroscopy is a very sensitive technique ; allowing us to see bacterial adhesion effect on functionalized surface Hydrophobic and hydrophilic bacteria have different effect on the ODT SAM conformation. These results have been quantified by numerical simulations. For the design of new materials, these conformational changes have to be taken into account. Prospects : - Effect of proteins and {proteins + bacteria} adsorption - use of a functionalized prism in internal reflection configuration without dependence of the solvent anymore + kinetic experiment Bulard et al. Langmuir 2011

11 Thank you for your attention ! Questions ??? ? ? ? AsGa à analyser

12 Simulations numériques avec Φ représentant l’orientation du plan des chaînes : l’intensité relative des bandes CH 3 est très sensible à cet angle. et θ = 30° l’angle d’inclinaison des chaînes alkyles ; ψ 1 = 90°/100° caractérisant le défaut en bas de chaîne La molécule d’ODT SAM est représentée par 3 angles : Φ, θ et ψ1

13 ODT à l’airODT dans l’eau 244/333 ± 2°250/340 ± 2° Φ tilt méthyl "ponté" 54 ± 0.7° 14 ± 0.7° 52.5 ± 0.7° 11.9 ± 0.7° tilt méthyl "ternaire" Φ tilt méthyl "ponté" ODT en présence de L.lactis hydrophiles 260/350 ± 3° ODT en présence de L.lactis hydrophobes 238/328 ± 3° 48.9 ± 1° 7.5 ± 1° 56.6 ± 0.7° 18.3 ± 0.7° tilt méthyl "ternaire" Simulations numériques

14 Dispositif expérimental : l’Amplificateur Paramétrique Optique (OPA) Cristal AgGaS 2 Cristal BBO Visible IR ω signal ω idler ω 800 ω idler = ω ω signalω IR = ω signal - ω idler Faisceau 800 nm pulsé fs La spectroscopie de Génération de Fréquence Somme (SFG)

15 Contrôle de l’adhésion bactérienne sur le support Introduction et enjeux La technique SFG L’adhésion bactérienne Les résultats Conclusion et perspectives Fluorescence : les bactéries ne sont pas naturellement fluorescentes. Coloration des bactéries avec l’orange d’acridine. Dépôt homogène des bactéries sur la surface La surface d’ODT SAM est recouverte de 60 ± 10 % de bactéries. 50 x 50 µm 2

16 ω1ω1 ω2ω2 ω 3 = ω 1 + ω 2 milieu non linéaire ω1ω1 ω2ω2 ω3ω3 Ep Principe : Energie C : CO/Pt B : ODT/Au A : AsGa 3 cas existent La spectroscopie de Génération de Fréquence Somme (SFG)

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18 SFG ω (cm -1 ) Air ω (cm-1) SFG Eau


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