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LES METHODES D’ETUDE DES COMPOSES PHENOLIQUES

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1 LES METHODES D’ETUDE DES COMPOSES PHENOLIQUES
Présenté par Aitfella radhia

2 Plan du travail Introduction 1. Définition
2. Classification des composés phénoliques MON PLAN DE TRAVAIL COMPREND Une introdu…. La déf des composés phéno, leur classi… et les principales méthodes d’étude 3. Méthodes d’étude des composés phénoliques

3 Introduction Plusieurs études ont consacrés ces quarante dernières années aux méthodes d’analyse des composés phénoliques, et ont permit de mettre en évidence à la fois les principales techniques modernes utilisées et les principaux résultats quant au dosage, caractérisation et identification de ces composés. Cet exposé consiste à présenter essentiellement les principales méthodes d’étude de ces composés les plus fréquemment utilisées, à savoir, les techniques de dosage, d’identification et de caractérisation des composés phénoliques d’origine végétale. Ces nombreuses techniques ont permis de confirmer et de préciser l’importance des composés phénoliques dans certaines technologies liées aux activités humaines, dans les domaines industriels, de l’environnement et de la santé humaine.

4 Éther Hétéroside Ester
1. Définition et généralités Végétaux / micro-organismes Les Végétaux OH Voies d’aromagenèse Les organismes animaux Éther Noyau benzénique V. Shikimate METABOLITES SECONDAIRES Alimentation ou symbiose V. Acétate Les composés phénoliques forment un très vaste ensemble de substances qu’il est difficile de définir simplement. L’élément structural fondamental qui les caractérise est la présence d’au moins un noyau benzénique auquel est directement lié au moins un groupe hydroxyle, libre ou engagé dans une autre fonction : éther, ester ou hétéroside Dans la nature, la synthèse du noyau aromatique est le fait des seuls végétaux et micro-organismes. Les organismes animaux sont en effet presque toujours tributaires, soit de leur alimentation, soit d’une symbiose, pour élaborer les métabolites qui leur sont indispensables (Bruneton, 1993) et qui comportent cet élément structural (aminoacides, vitamines, pigments, toxines…etc.). Plusieurs milliers de composés phénoliques ont été caractérisés jusqu’aujourd’hui chez les végétaux (Harborne, 1989). Ce sont des métabolites secondaires qui résultent de deux grandes voix d’aromagenèse : la voie shikimate et acétate Hétéroside (aminoacides, vitamines, pigments,…etc.) Ester

5 Les composés phénoliques
2. Classification Les composés phénoliques La complexité du squelette de base (allant d’un simple C6 à des formes très polymérisés) Phénols simples Tannins Le degré de modifications de ce squelette (degré d’oxydation, d’hydroxylation, de méthylation…), (C15)n C6 à C6-C4 Flavonoïdes Lignines Les liaisons possibles avec d’autres molécules (glucides, lipides, protéines, autres métabolites secondaires pouvant être ou non des composées phénoliques…). Les composés phénoliques peuvent être regroupés en de nombreuses classes (tableau.1) qui se différencient d’abord par : par la complexité du squelette de base (allant d’un simple C6 à des formes très polymérisés), ensuite par le degré de modifications de ce squelette (degré d’oxydation, d’hydroxylation, de méthylation…), et enfin par les liaisons possibles de ces molécules de bases avec d’autres molécules (glucides, lipides, protéines, autres métabolites, secondaires pouvant être ou non des composées phénoliques…). Sur ces trois caratéristiques On distingue plusieurs classes des composés phénoliques sont: Les phénols simples…..tel que les acides hydroxycinnamiques Les Stilibènes tel que le revesratrol Les flavonoides tel que cyanidine épicatéchine Les linignes présentes dans le bois et le noyau des fruits Les tannins comme ceux présents dans le raisins rouge ou le kaki On s’interesse essentiellement aux flv et aux tan C6 – C3- C6 (C6-C3)n Stilibènes C6 – C3- C6

6 Les tannins hydrolysables
Les anthocyanidines Les tannins Flavonoïdes Cyanidine Pélargonidine Les tannins condensés Les flavanes Les flavones Les flavonols Les flavanols Les tannins hydrolysables L’ensemble des flavonoïdes, de structure générale en C15 (C6-C3-C6), comprend à lui seul plusieurs milliers de molécules regroupés en plus de dix classes dont certaines ont une très grande importance biologique et technologique : - les anthocyanes tel que…présents dans les fruits rouges et fleurs - les flavones dont flavonols présentes dans les fruits, légumes, et fleurs tel que - les isoflavonoides dans le soja et le pois les flavanes dont les flavanols tel que dans la pomme et raisin et les falavnones tel que … dans le citrus Selon la nature des constituants impliqués et selon le type de condensation, les tannins sont des composés plus en moins complexes pouvant encore présenter une hydrosolubilité suffisante pour être présents dans la vacuole. Il est classique de distinguer deux grands groupes de tannins différents à la fois par leur réactivité chimique et par leur composition (Bruneton, 1993): les tannins hydrolysables et les tannins condensés. Kaempférol, Quecétine Catéchine, épicatéchine Les isoflavones Les flavanones Daidzéine Naringénine

7 Hydrolyse chimique/enzymatique
Les tannins condensés Les tannins hydrolysables Hydrolyse chimique/enzymatique Oligomères/polymères de Flavane-3-ols ou flavane-3,4-diols dérivés de la (+) catéchine Partie phénolique Partie non phénolique Résistants à l’hydrolyse Traitement acide à chaud Pigments rouges Les tannins hydrolysables: Ils sont abondants chez les dicotylédones et certains arbres en sont des sources industrielles : tannins de chêne, châtaigner, tannins de Chine ou de Turquie extraits respectivement d’un arbuste du genre Rhus ou de Quercus tinctoria (Quideau, 2009). Ils sont d’abord caractérisés par le fait qu’ils peuvent être dégradés par hydrolyse chimique (alcaline ou acide) ou enzymatique (Quideau, 2009). Ils libèrent alors une partie non phénolique (souvent du glucose ou de l’acide quinique) et une partie phénolique qui peut être de l’acide gallique (cas des gallotannins comme le tannin de chine, quelque fois appelé acide tannique), soit un dimère de ce même acide, l’acide éllagique (cas des tannins ellagiques ou ellagitannins comme ceux du châtaigner). Les tannins condensés sont des oligomères ou des polymères de flavane-3-ols (éventuellement de flavane-3,4-diols) dérivés de la (+)-catéchine ou de ses nombreux isomères (figure.6). Contrairement aux tannins hydrolysables, ils sont résistants à l’hydrolyse et seules des attaques chimiques fortes permettent des les dégrader. Ainsi, par traitement acide à chaud, ils se transforment en pigments rouges et, pour cette raison, les formes dimères ou oligomères sont dénommées proanthocyanidines. Gallotannins Acide gallique Glucose, ou l’acide quinique Proanthocyanidines Dimère de l’acide gallique Ellagitannins

8 3. Méthodes d’étude des composés phénoliques
Préparation des échantillons L’extraction des composés phénoliques Méthodes de séparation, de dosage et d’identification des composés phénoliques La premiere étape c’est la préparation des échantillons comprenant une étape d’extration des comp…. La deuxieme étape est ….. Notemment celles utilisant les spectres d’absorption des CP en …, et les méthodes chromatographiques… Par leurs spectres d’absorption en ultra violet ou en lumière visible  Par les méthodes chromatographiques

9 Extraction 1. Préparation des échantillons Broyage / homogénéisation
Grande variabilité des composés phénoliques / propriétés Broyage / homogénéisation Polarité Séchage / lyophilisation Ultrafiltration (échantillons liquides) Acidité Par conséquent, il est important de choisir convenablement une méthode optimale de prétraitement en accord avec les structures chimiques et les propriétés physicochimiques des composés phénoliques. Nombre Des Groupements Hydroxyles / Noyaux Aromatiques Une étape d’une importance capitale préalable à tout type d’analyse fiable. Plusieurs méthodes de préparation ont été développées afin de déterminer la fraction phénolique dans une large gamme de types d’échantillons. Hydrolyses chimiques ou enzymatiques (des glycosides/formes condensées) La préparation des échantillons est une étape d’une importance capitale préalable à tout type d’analyse fiable. Plusieurs méthodes de préparation des échantillons ont été développées afin de déterminer la fraction phénolique dans une large gamme de types d’échantillons. Cette étape peut considérablement varier ; à partir de la simple ultrafiltration dans le cas des différents échantillons liquides, jusqu’aux celles les plus compliquées, telle que l’hydrolyse des glycosides et les étapes d’extraction/purification. La problématique liée au choix des procédures de prétraitement est due à la grande variabilité des composés phénoliques et leurs nombreuses propriétés, notamment, leur polarité, acidité, nombre des groupements hydroxyles et des noyaux aromatiques, leur concentration, et la complexité de la matrice Par conséquent, il est important de choisir convenablement une méthode optimale de prétraitement en accord avec les structures chimiques et les propriétés physicochimiques des composés phénoliques. Les plantes étant solides sont généralement soumises à un broyage ou une homogénéisation ; les quelles peuvent être précédés par un séchage ou par une lyophilisation. Le matériel végétal est soumis par la suite à une extraction. C’est la principale étape de récupération et d’isolation des composés phénoliques bioactifs à partir du matériel végétal. Concentration Extraction Étapes d’extraction / purification Complexité de la matrice

10 Les facteurs : Concrète L’ absolu Extraction par expression
Dissoudre le composé recherché dans un solvant non miscible avec l’eau et à séparer la phase organique contenant le composé à extraire de la phase aqueuse. L’objectif de l’extraction c’est de libérer les composés phénoliques présents dans des structures vacuolaires par rupture du tissu végétal en utilisant plusieurs techniques: Les facteurs : pH du milieu d’extraction (degré de solubilité des substances) La nature du solvant Hexane, éther diéthylique, chloroforme, méthanol……. Extraction par expression Nombre d’extraction/ volume du solvant Extraction au fluide supercritique La tempréture: 0-4°C Agent réducteur L’extraction par les solvant consiste à dissoudre …… On utilise le plus souvent des solvants tel que …. Dont Chacun présente ces propre particularités : Après évaporation du solvant on obtient un produit dit … très coloré et aromatique et insoluble dans l’alcool. Une fois purifié par l’alcool absolu il donne un produit tout à fait pure dit… Les facteurs qui peuvent influencer l’extraction * Nature du solvant: eau, méthanol, acétonitrile, acétone, acétate d’éthyle. * Le pH du milieu d’extraction : détermine le degré de solubilité des substances solubles * La température : 25-55°C * Le nombre d’extractions et le volume du solvant utilisé La taille et la forme des particules : produit bien homogénéisé Comme les polyphénols sont facilement oxydables il recomender d’ajouter un agent réducteur ascorbique ou métabisulfite de soduim au milieu d’extraction d’un inhibiteur des glucosidases, enzymes pouvant encore fonctionner en milieu alcoolique ou acétonique, permet par ailleurs d’éviter l’hydrolyse d’hétérosides phénoliques fragiles lors de l’extraction Concrète Taille/forme des particules Inhibiteur des glucosidases Extraction par les solvants L’hydrodistillation L’ absolu

11 L’extraction des tannins
Distillation Tissus frais ou conservés par congélation ou lyophilisation Rendement optimal Dichlorométhane Mélange eau/acétone - Proanthocyanidols dimères - Tannins galliques Solution aqueuse Acétate d’éthyle L’extraction des tanins est, en règle générale, réalisée par un mélange d’eau et d’acétone (on évite le méthanol qui provoque la méthanolyse des depsides galliques). Un rendement optimal est obtenu avec les tissus frais ou conservés par congélation ou lyophilisation car, dans les drogues sèches, une partie des tannins est irréversiblement combinée à d’autres polymères. Après élimination de l’acétone par distillation, la solution aqueuse est débarrassées des pigments et des lipides par un solvant (ex : dichlorométhane). Une extraction de cette solution aqueuse par l’acétate d’éthyle permet de séparer les proanthocyanidols dimères et la plupart des tannins galliques. Les proanthocyanidols polymères et les tannins galliques de masse moléculaire élevée restent dans la phase aqueuse (Bruneton, 1993). Proanthocyanidols polymères Tannins galliques PM élevé…

12 UV / visible Tous les composés phénoliques
2. Méthodes de séparation, de dosage et d’identification des composés phénoliques Dosage des composés phénoliques La loi de Beer-Lambert Coloration des organes végétaux (fleurs, fruits…) DO =  C d UV / visible Méthodes spectrophotométriques ou colorimétriques  Cycles benzéniques Tous les composés phénoliques absorbent en UV et certains d’entre eux (anthocyanine, flavonols, chalcones, aurones, mélanines…) absorbent également dans le visible, et participent alors à la coloration des organes végétaux (fleurs, fruits…) et des produits qui en dérivent. Le spectre d’absorption résulte de la présence combiné du (ou des) cycle (s) benzénique (s), des fonctions hydroxyles (phénoliques) portées par ce (s) cycle (s), et des différentes doubles liaisons présentes dans la molécule. Le dosage des composés phénoliques utilise très fréquemment leur spectre d’absorption, soit dans le visible, soit dans l’UV, en choisissant pour chacun d’eux la longueur d’onde d’absorption maximale, en utilisant la loi classique de Beer-Lambert qui lie cette concentration C en mol/L à densité optique DO mesurée sur le spectre d’absorption : C’est sur ce principe que fonctionnent la plupart des détecteurs qui équipent les appareils de chromatographie, qu’il s’agisse de chromatographie classique sur colonne ou de chromatographie liquide à hautes performance. C’est sur ces méthodes color…que se sont développé plusieurs techniques de dosage… Fonctions hydroxyles (phénoliques) Doubles liaisons

13 Dosage total des composés phénoliques Le réactif de Folin-Ciocalteu
Phosphotungstiate (WO42-)- Phosphomolybdate (MoO4 2-) Acide ascorbique Oxydation des phénolates, réduction des polyhétérocycles Extraits suffisamment purifiés Ces méthodes sont utilisées pour par exemple le dosage total des composés phénoliques basé sur l’oxydo-réduction réactif de Folin-Ciocalteu : acide de couleur jaune, constitué de polyhétérocycles acides contenant du molybdène et tungstène Réaction : oxydation des phénolates réduction des polyhétérocycles formation d’un complexe molybdène-tungstène bleu mesuré au spectro-photomètre Cette méthode est très sensible mais malheureusement peu spécifique, car beaucoup d’autres composés réducteurs peuvent interférer, en particulier l’acide ascorbique. Il est donc vivement recommandé de ne l’utiliser que sur des extraits suffisamment purifiés, et de réaliser des témoins négatifs (Vermerris and Nicholson, 2006), par exemple à l’aide d’un deuxième dosage après avoir enlevé les phénols de l’extrait (par adsorption sur du polyvinylpyrrolidonne insoluble). Par différence, on peut avoir alors une bonne approximation de la teneur de l’extrait en phénols que l'on exprime alors à un composé de référence (par exemple en équivalents d’acide chlorogénique, ou gallique). Réaliser des témoins négatifs Formation d’un complexe molybdène-tungstène bleu mesuré au spectro-photomètre Exprimer la teneur à un composé de référence (par exemple en équivalents d’acide chlorogénique, ou gallique).

14 Dosage des flavonoïdes La méthode du trichloride d’aluminium (AlCl3)
Tannins condensés Dosage des tannins La technique au butanol-HCl La technique à la vanilline Dosage des flavonoïdes La méthode du trichloride d’aluminium (AlCl3) Précipitation par le formaldéhyde Tannins hydrolysables La quercétine Les gallotannins Les ellagitannins La teneur totale en flavonoïdes des extraits végétaux peut être estimée par la méthode d’Oxydation trichloride d’aluminium (AlCl3). La quercétine est utilisée comme composé de référence afin de réaliser la courbe d’étalonnage. L’oxydation à l’acide nitreux Par l’iodate de potassium Le Catéchol Par la rhodanine La technique au NaNO2/HCl

15 Identification chimique spécifique et caractérisation
Des supports chromatographiques (cellulose du des couches minces, silice, polyamide…), Les méthodes chromatographiques De (s) groupement(s) phénolique(s) porté(s) par le cycle benzénique Sur papier, sur couches minces Des solvants d’élution (pH, large gamme de polarité depuis l’eau très polaire jusqu’au benzène fortement apolaire) Les méthodes électrophorétiques Sur papier Cycle (s) benzénique (s) Les propriétés chimiques des composés phénoliques eux même qui permettent leurs révélations caractéristiques sur les chromatogrammes. ces méthodes colorométriques ne fournissent pas assez d’informations sur leur composition chimique spécifique. Afin de caractériser l’ensemble de ces composés phénoliques, une variété de méthodes de séparation et d’identification existe. Avant l’introduction de la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), les séparations chromatographiques sur papier, sur couches minces ou sur colonnes avaient été largement développées pour l’analyse des composés phénoliques, ainsi que les séparations par électrophorèse sur papier (Markham and Bloor, 1998). Ces techniques gardent encore un certain intérêt pour réaliser une première approche qualitative concernant un matériel végétal inconnu Ces méthodes combinent de trois paramètres permettant ainsi de multiples séparations (Macheix et al., 2005) : d’abord la nature des supports chromatographiques (cellulose du des couches minces, silice, polyamide…), ensuite celle des solvants d’élution (pH, large gamme de polarité depuis l’eau très polaire jusqu’au benzène fortement apolaire) et enfin les propriétés chimiques des composés phénoliques eux même qui permettent leurs révélations caractéristiques sur les chromatogrammes. Parmi ces multiples propriétés des composés phénoliques, certains ont des applications directes en chromatographie: d’une part celles du (ou des) groupement(s) phénolique(s) porté(s) par le cycle benzénique : D’une part celles liées au cycle benzénique, souvent associées à des réactions colorées permettant de visualiser les composés phénoliques Une première approche qualitative concernant un matériel végétal inconnu.

16 l’acide nitreux (milieu acétique)
l’iodate de potassium Examen en UV Les tannins Les gallotannins Révélateurs Coloration rose Sels ferriques Coloration, précipité bleu noir Les tannins hydrolysables l’acide nitreux (milieu acétique) En CCM, les tannins sont révélés par examens en fluorescence en UV et par plusieurs réactifs. Avec les sels ferriques les tannins galliques et ellagiques donnent des colorations et des précipités bleu-noir et les tannins condensés des précipités brun verdâtres. Les tannins galliques donnent une coloration rose avec l’iodate de potassium (l’acide gallique libre est coloré en orange par ce réactif). Les tannins ellagiques sont colorés par l’acide nitreux en milieu acétique (d’abord rose, la coloration vire au pourpre puis en bleu) et les tannins sont colorés en rouge par la vanilline chlorhydrique (Bruneton, 1993). Les ellagitannins Coloration rose Les tannins condensés Coloration, précipité brun verdâtres

17 Acide sulfurique/NH4OH La réaction à la cyanidine
Les flavonoïdes Bleu violacé Acide sulfurique/NH4OH Anthocyane Rose orangée Flavone Rose- violacée La réaction à la cyanidine La réaction à la cyanidine rose orangée (flavones) ou rose- violacée (flavanones) ou rouge (flavonones, flavanonols) Flavanones Rouge flavonones, flavanonol

18 Chrommatographie liquide à haute performance (CHLP)
Phase stationnaire de silice Chrommatographie liquide à haute performance (CHLP) Lumière visible pour les anthocyanes (vers 520nm) Composés phénoliques non polaires Solvant apolaire de composition constante (par exemple le mélange héptane-éthanol) Des phases stationnaires UV (280, 325 ou 360nm) pour tous les autres phénols  Une faible quantité d’échantillon végétal solvant d’élution La surface de chacun des pics est proportionnelle à la concentration du composé. Fixation sur une phase dite inversée La silice sur la quelle on a préalablement greffé des chaines aliphatiques apolaires combine en une seule opération rapide et reproductible les analyses qualitatives et quantitatives d’un extrait phénolique complexe Composés phénoliques (degré d’hydroxylation, glycosylation, et méthylation) Dosé à la longueur d’onde choisie pour l’analyse par référence à des composés témoins obtenus commercialement ou à partir d’analyses antérieures. CHLP/UV et CHLP/spectrométrie de masse La chromatographie liquide à haute performance (CHLP) est, de très loin, la technique la plus performante et la plus utilisée pour la séparation et le dosage des composé phénoliques comme en témoignent les excellentes séparations déjà obtenues (figure.13) il y’a plus de quarante ans (Wulf and Nagel, 1978 ; Moller and Harrmann, 1982). Elle ne demande qu’une faible quantité d’échantillon végétal, et permet de combiner en une seule opération rapide et reproductible les analyses qualitatives et quantitatives d’un extrait phénolique complexe, ce qui a permis l’étude de matériaux végétaux très variés (Pietta et al., 2003 ; Sakakibara et al., 2003). Les séparations sont basées sur les polarités respectives des phases stationnaires utilisées, du solvant d’élution et des composés phénoliques concernés, en particulier leur degré d’hydroxylation, de glycosylation et de méthylation. A partir de ces principes généraux, deux approches analytiques sont possibles (Macheix et al., 2005) : D’une part, la chromatographie de composés phénoliques non polaires sur une phase stationnaires de silice avec élution par un solvant apolaire de composition constante (par exemple le mélange héptane-éthanol), d’autre part, ce qui est le plus utilisé dans le monde des composés phénoliques, la fixation de ces composés sur une phase dite inversée (par exemple de la silice sur la quelle on a préalablement greffé des chaines aliphatiques apolaires) suivie de leur élution par un mélange de solvants (fréquemment eau/acide acétique/acétonitrile ou eau/méthanol) dont on fait varier la composition donc la polarité avec le temps de l’analyse. Les composés élués sont généralement repérés en sortie de colonne par leur absorption en lumière visible pour les anthocyanes (vers 520nm) et en ultraviolet (280, 325 ou 360nm) pour tous les autres phénols ; ils apparaissent alors sous forme de pics sur les chromatogrammes (figure.13). La surface de chacun des pics est proportionnelle à la concentration du composé, qui est alors dosé à la longueur d’onde choisie pour l’analyse par référence à des composés témoins obtenus commercialement ou à partir d’analyses antérieures. Grace aux progrès de l’informatique et de la microélectronique, les détecteurs dits à barrette de diode permettent d’obtenir simultanément des réponses pour toutes les longueurs d’onde du spectre, ce qui conduit à une première étape de caractérisation de chacun des composés séparés, en comparant leurs spectres d’absorption avec celui de témoins (Macheix et al., 2005). élution par un mélange de solvants (fréquemment eau/acide acétique/acétonitrile ou eau/méthanol) dont on fait varier la composition (la polarité) avec le temps de l’analyse.

19 Conclusion Des avancés spectaculaires et l’amélioration des techniques analytiques et des approches moléculaires ont aujourd’hui permis de confirmer et de préciser la diversité et l’importance de ces composés phénoliques végétales. Notamment la reconnaissance de leur activité anti-oxydante mais également anti-inflammatoire et antimicrobienne. elle est pour une part à l’origine du regain d’intérêt que l’on porte à ces composés dans le domaine de la nutrition et de la pharmacologie.

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