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Présenté par Aitfella radhia 2009-2010. Plan du travail Introduction 1. Définition 3. Méthodes d’étude des composés phénoliques 2. Classification des.

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1 Présenté par Aitfella radhia

2 Plan du travail Introduction 1. Définition 3. Méthodes d’étude des composés phénoliques 2. Classification des composés phénoliques

3 Plusieurs études ont consacrés ces quarante dernières années aux méthodes d’analyse des composés phénoliques, et ont permit de mettre en évidence à la fois les principales techniques modernes utilisées et les principaux résultats quant au dosage, caractérisation et identification de ces composés. Ces nombreuses techniques ont permis de confirmer et de préciser l’importance des composés phénoliques dans certaines technologies liées aux activités humaines, dans les domaines industriels, de l’environnement et de la santé humaine. Cet exposé consiste à présenter essentiellement les principales méthodes d’étude de ces composés les plus fréquemment utilisées, à savoir, les techniques de dosage, d’identification et de caractérisation des composés phénoliques d’origine végétale. Introduction

4 1. Définition et généralités Noyau benzénique OH Éther Ester Hétéroside Végétaux / micro- organismes Les organismes animaux Alimentation ou symbiose Les Végétaux METABOLITES SECONDAIRES V. Shikimate V. Acétate (aminoacides, vitamines, pigments,…etc.)

5 2. Classification La complexité du squelette de base (allant d’un simple C6 à des formes très polymérisés) Le degré de modifications de ce squelette (degré d’oxydation, d’hydroxylation, de méthylation…), Les liaisons possibles avec d’autres molécules (glucides, lipides, protéines, autres métabolites secondaires pouvant être ou non des composées phénoliques…). Phénols Phénolssimples simples C6 à C6-C4 FlavonoïdesFlavonoïdes C6 – C3- C6 LigninesLignines (C6-C3)n (C15)n TanninsTannins StilibènesStilibènes

6  Les anthocyanidines  Les flavones  Les flavanes Les isoflavones Les flavonols Les flavanols Les flavanones Cyanidine Pélargonidine Kaempférol, Quecétine Daidzéine Catéchine, épicatéchine Naringénine

7 Hydrolyse chimique/enzymatique Glucose, ou l’acide quinique Acide gallique Gallotannins Dimère de l’acide gallique Ellagitannins Oligomères/polymères de Flavane-3-ols ou flavane- 3,4-diols dérivés de la (+) catéchine Résistants à l’hydrolyse Traitement acide à chaud Pigments rouges ProanthocyanidinesProanthocyanidines

8 3. Méthodes d’étude des composés phénoliques Préparation des échantillons  L’extraction des composés phénoliques Méthodes de séparation, de dosage et d’identification des composés phénoliques  Par leurs spectres d’absorption en ultra violet ou en lumière visible  Par les méthodes chromatographiques

9 1. Préparation des échantillons Ultrafiltration (échantillons liquides) Hydrolyses chimiques ou enzymatiques (des glycosides/formes condensées) Étapes d’extraction / purification Grande variabilité des composés phénoliques / propriétésPolarité Acidité Nombre Des Groupements Hydroxyles / Noyaux Aromatiques Concentration Complexité de la matrice Broyage / homogénéisation Séchage / lyophilisation Une étape d’une importance capitale préalable à tout type d’analyse fiable. Plusieurs méthodes de préparation ont été développées afin de déterminer la fraction phénolique dans une large gamme de types d’échantillons. Par conséquent, il est important de choisir convenablement une méthode optimale de prétraitement en accord avec les structures chimiques et les propriétés physicochimiques des composés phénoliques.

10 L’objectif de l’extraction c’est de libérer les composés phénoliques présents dans des structures vacuolaires par rupture du tissu végétal en utilisant plusieurs techniques: Dissoudre le composé recherché dans un solvant non miscible avec l’eau et à séparer la phase organique contenant le composé à extraire de la phase aqueuse. Hexane, éther diéthylique, chloroforme, méthanol……. Concrète L’ absolu La nature du solvant pH du milieu d’extraction (degré de solubilité des substances) La tempréture: 0-4°C Nombre d’extraction/ volume du solvant Taille/forme des particules Agent réducteur Inhibiteur des glucosidases Les facteurs :

11 L’extraction des tannins Tissus frais ou conservés par congélation ou lyophilisation Rendement optimal DistillationDistillation Dichlorométhane Solution aqueuse

12 2. Méthodes de séparation, de dosage et d’identification des composés phénoliques Méthodes spectrophotométriques ou colorimétriques Méthodes spectrophotométriques ou colorimétriques Tous les composés phénoliques UV / visible Coloration des organes végétaux (fleurs, fruits…) Cycles benzéniques Cycles benzéniques Fonctions hydroxyles (phénoliques) Fonctions hydroxyles (phénoliques) Doubles liaisons Doubles liaisons Dosage des composés phénoliques La loi de Beer- Lambert DO =  C d

13 Dosage total des composés phénoliques Phosphotungstiate (WO 4 2- )- Phosphomolybdate (MoO 4 2- ) Oxydation des phénolates, réduction des polyhétérocycles Oxydation des phénolates, réduction des polyhétérocycles Le réactif de Folin- Ciocalteu Formation d’un complexe molybdène-tungstène bleu mesuré au spectro-photomètre Formation d’un complexe molybdène-tungstène bleu mesuré au spectro-photomètre Acide ascorbique Extraits suffisamment purifiés Extraits suffisamment purifiés Réaliser des témoins négatifs Réaliser des témoins négatifs Exprimer la teneur à un composé de référence (par exemple en équivalents d’acide chlorogénique, ou gallique). Exprimer la teneur à un composé de référence (par exemple en équivalents d’acide chlorogénique, ou gallique).

14 Dosage des tannins Tannins condensés La technique au butanol-HCl La technique au butanol-HCl La technique à la vanilline La technique à la vanilline Précipitation par le formaldéhyde Précipitation par le formaldéhyde Par l’iodate de potassium Par l’iodate de potassium Tannins hydrolysables Les gallotannins Par la rhodanine Par la rhodanine La technique au NaNO 2 /HCl La technique au NaNO 2 /HCl L’oxydation à l’acide nitreux L’oxydation à l’acide nitreux Les ellagitannins Dosage des flavonoïdes La méthode du trichloride d’aluminium (AlCl 3 ) La quercétine Le Catéchol

15 Des solvants d’élution (pH, large gamme de polarité depuis l’eau très polaire jusqu’au benzène fortement apolaire) Des solvants d’élution (pH, large gamme de polarité depuis l’eau très polaire jusqu’au benzène fortement apolaire) Identification chimique spécifique et caractérisation Les méthodes chromatographiques Sur papier, sur couches minces Les méthodes électrophorétiques Une première approche qualitative concernant un matériel végétal inconnu. Sur papier Des supports chromatographiques (cellulose du des couches minces, silice, polyamide…), Des supports chromatographiques (cellulose du des couches minces, silice, polyamide…), Les propriétés chimiques des composés phénoliques eux même qui permettent leurs révélations caractéristiques sur les chromatogrammes. Les propriétés chimiques des composés phénoliques eux même qui permettent leurs révélations caractéristiques sur les chromatogrammes. De (s) groupement(s) phénolique(s) porté(s) par le cycle benzénique Cycle (s) benzénique (s)

16 Les tannins Examen en UV Examen en UV Révélateurs Révélateurs Les tannins hydrolysables Coloration, précipité bleu noir Les tannins condensés Coloration, précipité brun verdâtres  Sels ferriques Les gallotannins Coloration rose Les ellagitannins Coloration rose  l’iodate de potassium  l’acide nitreux (milieu acétique)

17 Les flavonoïdes Acide sulfurique/NH4OH Bleu violacé Anthocyane La réaction à la cyanidine Rose orangée Flavone Rose- violacée Flavanones Rouge flavonones, flavanonol

18 Chrommatographie liquide à haute performance (CHLP) Une faible quantité d’échantillon végétal Une faible quantité d’échantillon végétal combine en une seule opération rapide et reproductible les analyses qualitatives et quantitatives d’un extrait phénolique complexe combine en une seule opération rapide et reproductible les analyses qualitatives et quantitatives d’un extrait phénolique complexe Des phases stationnaires Des phases stationnaires solvant d’élution solvant d’élution Composés phénoliques (degré d’hydroxylation, glycosylation, et méthylation) Composés phénoliques (degré d’hydroxylation, glycosylation, et méthylation) Composés phénoliques non polaires Phase stationnaire de silice Solvant apolaire de composition constante (par exemple le mélange héptane-éthanol) Fixation sur une phase dite inversée La silice sur la quelle on a préalablement greffé des chaines aliphatiques apolaires élution par un mélange de solvants (fréquemment eau/acide acétique/acétonitrile ou eau/méthanol) dont on fait varier la composition (la polarité) avec le temps de l’analyse. Lumière visible pour les anthocyanes (vers 520nm) UV (280, 325 ou 360nm) pour tous les autres phénols UV (280, 325 ou 360nm) pour tous les autres phénols La surface de chacun des pics est proportionnelle à la concentration du composé. Dosé à la longueur d’onde choisie pour l’analyse par référence à des composés témoins obtenus commercialement ou à partir d’analyses antérieures.

19 Conclusion Des avancés spectaculaires et l’amélioration des techniques analytiques et des approches moléculaires ont aujourd’hui permis de confirmer et de préciser la diversité et l’importance de ces composés phénoliques végétales. Notamment la reconnaissance de leur activité anti- oxydante mais également anti-inflammatoire et antimicrobienne. elle est pour une part à l’origine du regain d’intérêt que l’on porte à ces composés dans le domaine de la nutrition et de la pharmacologie.

20 Merci pour votre attention


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