CHMI 3216F – A20091 Bioingénierie de l’ADN CHMI 3216 F Semaine du 2 novembre 2009 Mutagenèse.

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1 CHMI 3216F – A20091 Bioingénierie de l’ADN CHMI 3216 F Semaine du 2 novembre 2009 Mutagenèse

2 CHMI 3216F – A20092 Clones d’ADNc! Ori C Amp R Sequencing Restriction mapping Sub-cloning Identification Expressed sequence tag (EST) mRNA expression Mutagenesis Complete? Blast probe 5’/3’ RACE

3 CHMI 3216F – A20093 Mutagenèse Outils Oligonucléotides PCR Substances mutagène Enzymes de restriction

4 CHMI 3216F – A20094 Digestion avec des enzymes de restriction

5 CHMI 3216F – A20095 Digestion avec des enzymes de restriction

6 CHMI 3216F – A20096 Mutagenèse chimique OriC F1 ori AmpR 1) Transforme E. coli 2) Infection avec un phage auxiliaire: - initiation de la synthèse d’ADNsb à partir de l’origine F1 - empaquetage de l’ADNsb dans des particules virales OriC F1 ori AmpR

7 CHMI 3216F – A20097 Mutagenèse dirigée

8 CHMI 3216F – A20098 Utilisation de souches de E. coli ung -

9 CHMI 3216F – A20099 Mutagenèse par PCR Très utile pour l’introduction d’insertions, de délétions, et de mutations ponctuelles. Utilisation d’amorces modifiées portant la mutation désirée.

10 CHMI 3216F – A200910 Error-prone PCR Type modifié de PCR où des conditions expérimentales sont choisies afin de diminuer la fidélité de l’ADN polymérase: –Utilisation d’une polymérase dénuée d’activité d’édition (e.g. Taq DNA Pol) –Température d’hybridation faible; –Concentration faible ou inégale des dNTPs –Concentration élevée de Mg +2 –Nombre de cycles élevé Permet la création d’une banque de produite de PCR mutés, que l’on clone dans un plasmide d’intérêt; On teste ensuite les produits de PCR pour les mutations conférant les propriétés désirées (activité enzymatique altérée, augmentation de la stabilité de l’ARNm/protéine, etc.).