BIOTECHNOLOGIES EN SYSTÈME ANIMAL SUPERIEUR

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1 BIOTECHNOLOGIES EN SYSTÈME ANIMAL SUPERIEUR
UE Biotechnologie Licence 3ème année – S6 Christel BAUDET Patrick AUGUSTE BIOTECHNOLOGIES EN SYSTÈME ANIMAL SUPERIEUR

2 PLAN GENERAL Introduction Production de protéines recombinantes:
En culture de cellules eucaryotes supérieurs Chez l’animal génétiquement modifié Utilisation des cellules souches Production à grande échelle de souris knock-out/knock-in

3 Production de protéines recombinantes en culture de cellules eucaryotes supérieurs

4 -Pourquoi faire exprimer des protéines en grande quantité?

5 Exemples de l’intérêt de la production de protéine recombinante en système animal
Le facteur VIII utilisé pour le traitement des hémophiles: un an de traitment = 4000 litres de sang humain L’insuline pour les diabétiques: 70 pancréas de cochons L’hormone de croissance historiquement extraite d’hypophyse de cadavres humains

6 Mucoviscidose cardiaques

7 -Quels sont les domaines concernés?

8 Domaines d’applications:
Médical Recherche Agriculture Environnement Industrie

9 Quelles sont les différents organismes cellulaires utilisés pour faire exprimer des protéines recombinantes?

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11 Avant de débuter une production de protéines recombinantes il faut se poser un certain nombre de questions, lesquelles?

12 -Niveau de production (quantité)
-Modifications post-traductionnelles Maturation, repliement (ponts disulfures) -La protéine produite doit-elle être soluble et fonctionnelle -Purification ou non -Coût -Equipement disponible

13 -Niveau de production (quantité)
-Modifications post-traductionnelles Maturation, repliement (ponts disulfures) -La protéine produite doit-elle être soluble et fonctionnelle -Purification ou non -Coût -Equipement disponible

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15 -Niveau de production (quantité)
-Modifications post-traductionnelles Maturation, repliement (ponts disulfures) -La protéine produite doit-elle être soluble et fonctionnelle -Purification ou non -Coût -Equipement disponible

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17 Les modifications post-traductionnelles des cellules de mammifères

18 -Niveau de production (quantité)
-Modifications post-traductionnelles Maturation, repliement (ponts disulfures) -La protéine produite doit-elle être soluble et fonctionnelle -Purification ou non -Coût -Equipement disponible

19 -Niveau de production (quantité)
-Modifications post-traductionnelles Maturation, repliement (ponts disulfures) -La protéine produite doit-elle être soluble et fonctionnelle -Purification ou non -Coût -Equipement disponible

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22 -Niveau de production (quantité)
-Modifications post-traductionnelles Maturation, repliement (ponts disulfures) -La protéine produite doit-elle être soluble et fonctionnelle -Purification ou non -Coût -Equipement disponible

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24 -Niveau de production (quantité)
-Modifications post-traductionnelles Maturation, repliement (ponts disulfures) -La protéine produite doit-elle être soluble et fonctionnelle -Purification ou non -Coût -Equipement disponible

25 Schéma général d’obtention d’une protéine recombinante
dans un système eucaryote supérieur

26 Infection

27 Quel système de production choisir? Couple: cellule-vecteur

28 Types de cellules animales
Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire. Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Peut être cultivée en suspension. Peut être indifférenciée. Durée de vie limitée (30-50 divisions). Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire immortalisée ou transformée. Durée de vie illimitée (congélation).

29 Différentes lignées Sf9, Spodoptera frugiperda, stable, système d’expression baculovirus. S2: cellules de drosophiles. MRC5, W138: secondaires, fibroblastes poumons humains, adhérentes, vaccins. HeLa: cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche. CHO: ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension, versatile. Vero: reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile. HEK-293: embryon de rein humain, transformée par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension (293S). MDCK: rein normal de chien. CEF: fibroblastes d’embryon de poulet, vaccins.

30 Plasmides Bactérie: Hôte de production du plasmide recombinant

31 Pourquoi utiliser des systèmes viraux?

32 Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs d’expression de gènes Problèmes liés aux ADN nus: efficacité, ciblage Les virus constituent des systèmes d’expression spécialisés Pouvant être adaptés pour exprimer selon nos besoins des protéines d’intérêt dans une cellule cible eucaryote supérieur Production de protéines recombinantes. Thérapie génique.

33 Comment peut-on utiliser un virus pour lui faire exprimer une protéine d’intérêt?

34 Construction d’un virus recombinant réplicatif pour la biotechnologie
Connaitre le génome viral Identifier dans le génome viral un gène non essentiel à la réplication (connaître le cycle réplicatif du virus) Remplacer ce gène par le transgène

35 Quels sont les virus utilisés
pour l’expression des protéines recombinantes dans un système eucaryote supérieur?

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37 DÉRIVÉ DE VIRUS DE LA VACCINE
Exemple historique de production de protéine en système mammifère DÉRIVÉ DE VIRUS DE LA VACCINE

38 Cycle du virus de la vaccine (pox)
Virus ADN double-brin linéaire (200 kb) 10% des protéines totales de la cellule sont des protéines de la vaccine Cycle entièrement cytoplasmique Infection de tout type cellulaire mammifère et aviaire (sauf CHO)

39 Identifier un gène non important pour la réplication?

40 Le gène codant pour la protéine thymidine Kinase (TK) n’est pas essentiel à l’infection virale dans des cellules en division Principe : Introduire le TG par recombinaison homologue dans le gène TK Conclusion: ce virus recombinant n’expriment plus la TK

41 Comment faire pour obtenir un virus recombinant exprimant la protéine d’intérêt?

42 Construction de virus recombinants Methode 1
Virus de la Vaccine WT Infection pro MCS Transgène Séquences du gène TK Promoteur fort eg P11 Vaccine 5’ 3’ Choix du promoteur (précoce ou tardif) Transfection Noyau Cellules eucaryotes Plasmide Recombinaison homologue 0,1 à 0,5% Virus de la vaccine Recombinant (TK-/TG+) + virus WT (99,9%)

43 Problèmes -Obtention de grandes quantités du plasmide recombinant
-Obtention du virus recombinant pur

44 du plasmide recombinant
Obtention de grandes quantités du plasmide recombinant CHEZ LA BACTERIE

45 Comment faire pour sélectionner les virus recombinants?

46 Sélection et purification des virus recombinants
Méthode 1 Sélection des virus TK-: en présence de BrdU (5-bromodéoxyuridine) , la TK phosphoryle le BrdU qui est incorporé dans le génome viral (létal)

47 Sélection et purification des virus recombinants Méthode 2
Sélection des virus TK-: sélection en incorporant un gène de résistance aux antibiotiques ou le gène lacZ (bleu)

48 Sélection et purification des virus recombinants
Par dilution limite (plage de lyse) Plusieurs cycles nécessaires Dans chaque boite: -cellules eucaryotes sup qui sont infectées par des dilutions limites du mélange viral -sélection: soit à la TK soit à la b-galactosidase (ci-dessus) -Les virus de la boite 1 (positive pour la b-galactosidase) sont récupérés et un nouveau cycle de purification est effectué.

49 Sélection et purification des virus recombinants
Contrôle de l’expression des TG PCR Western Blot

50 Recombinaison homologue Sélection et purification
Construction de virus Methode 2: système binaire vaccine-T7pol Construction d’un virus de la vaccine recombinant exprimant la T7 Pol Transfection Noyau Cellules eucaryotes pro T7pol 5’ 3’ Recombinaison homologue 0,1 à 0,5% Sélection et purification de virus de la vaccine recombinant exprimant la T7 Pol Virus de la Vaccine (WT) Infection Plasmide

51 Expression de gènes sous le contrôle de la T7 polymérase
VV: T7 Pol 3. Infection 1. Construction d’un plasmide pro MCS Transgène Promoteur T7 Pol 2. Transfection Noyau pro TG T7 polymérase exprimée par le VV ARNm Protéines Plasmide

52 Avantages/Inconvénients
-Expression aisée de multiples constructions -Transcription cytoplasmique (pas de problème d ’export des ARNm, pas d ’épissage) -La transfection est une étape limitante pour les productions industrielles

53 Utilisation de la technique dans les vaccinations
Virus de la Vaccine: souche ANKARA Infection pro MCS Transgène Séquences du gène TK Promoteur fort eg P11 Vaccine 5’ 3’ Choix du promoteur (précoce ou tardif) Transfection Noyau Cellules eucaryotes Plasmide Recombinaison homologue 0,1 à 0,5% virus WT (99,9%) + Virus de la vaccine Recombinant (TK-/TG+) Vaccination chez l’homme

54 Utilisation de la technique dans les vaccinations: exemple de la grippe aviaire (H5N1)

55 Exemple de la grippe aviaire H5N1 Recombinant (TK-/TG+)
Virus de la Vaccine: souche ANKARA Infection pro MCS Hemmaglutinine 5’ 3’ Transfection Noyau Cellules: fibroblastes d’embryon de poulet (CEF) Virus de la vaccine Recombinant (TK-/TG+) + virus WT (99,9%)

56 -Sélection des virus de la vaccine recombinants:
-Amplification des virus par infection de CEF -Purification des virus: ultracentifugation -Vaccine des souris HA HK HA VN

57 Est-ce que les souris vaccinées ont développé des anticorps?

58 Anticorps contre Injection 1 injection 2 injections
NIBRG-14 : injection contrôle positif Reconnaissance de H5N1 HK: noir H5N1 VN: gris clair H5N1 Indonésia: gris moyen

59 Est-ce que les souris vaccinées résistent à une infection H5N1?

60 -Regarde la présence du virus ayant servit à l’infection dans différents organes:
-Regarde la perte de poids des souris vaccinées après infection par les virus H5N1 H5N1 infectieux H5N1 infectieux

61 Avantages de l’utilisation du virus de la vaccine dans les vaccinations
-Virus de la vaccine de type Ankara n’induit pas de complications chez l’homme, y compris chez les immunodéprimés. -Très facile de le produire en très grande quantité et dans des conditions de bio-sécurité très bonne. -Peut-être produit dans des CEFs ou des BHKs. -Virus très stable. -Peu le stocker très facilement pendant très longtemps. -Très immunogène. -Nombreux essais cliniques.

62 Conclusion sur l’utilisation du virus de la vaccine pour la production de protéines recombinantes.

63 Constructions de virus recombinants :
Utilisation principale : expression de protéines en cellules mammifères Constructions de virus recombinants : Choix possible du promoteur (précoce ou tardif, fort ou faible) Sélection des virus recombinants et purification longues Production de stocks de virus recombinants facile Inconvénients Les virus WT et recombinants sont infectieux et immunogène pour l ’homme (yeux) :utiliser la souche Ankara MVA atténuée Le virus perturbe les métabolismes cellulaires :Expression des protéines endogènes  Effet cytopathique : les cellules infectées meurent 48 h après infection Infecte seulement les cellules en division Avantages Niveau d’expression élevé Modifications post-traductionnelles ad-hoc (glycosylation, clivages protéolytiques) Taille des inserts > 20kb Production aisée de titres infectieux (1010 PFU/ml) Choix du promoteur (précoce ou tardif) Vecteur de choix pour les vaccinations Transcription cytoplasmique (pas de problème d ’export des ARNm, pas d ’épissage)

64 Production de protéines recombinantes par le baculovirus

65 Qu’est-ce que le baculovirus?

66 Virus enveloppé à ADN double brin circulaire (130 kb)
En forme de bâtonnets Inclusion dans les cristaux de polyhédrine BV: nucléocapside enveloppée par GP64 OV ou ODV: nombreux BV inclus dans une matrice de polyhédrine MNPV (Multicapsid NucleoPolyhedroVirus) infecte spécifiquement les larves de lépidoptères La souche la plus utilisée: Autographa california (AcMNPV) Le promoteur de la polyhédrine est l’élément majeur des systèmes d’expression

67 Le cycle du Baculovirus

68 Pourquoi l’utiliser pour la production de protéines recombinantes?

69 ADN viral nu infectieux!
Niveau d’expression très élevé pouvant atteindre 50% des protéines cellulaires totales, en général solubles et fonctionnelles Modifications post-traductionnelles : Ponts disulfures et conformation 3D des protéines Clivage du peptide signal Glycosylation de type N et O Assemblage hétérodimérique possible Cultures faciles en suspension Peu cher comparé aux autres systèmes eucaryotes supérieurs

70 Utilisation de vecteur baculoviral
Pfizer 2007 GTP

71 Est-ce que les modifications post-traductionnelles sont les mêmes que chez les mammifères?

72 Modifications post-traductionnelles
Les cellules d’insectes n’ajoutent pas d’acide sialique sur les résidus glycosylés, modification essentielle pour beaucoup de fonctions mammifères (interactions cellulaires, réactions immunitaires)

73 Phosphorylations Les protéines recombinantes sont souvent hyperphosphorylées (activité kinase +++ des cellules d’insectes) Problème des sérines près des tag His MHHHHHHSSGLVPRGS dans les vecteurs commerciaux --> aggrégation et résistance au clivage par la thrombine : Leu-Val—Pro-Arg-Gly-Ser On peut traiter la protéine recombinante à la phosphatase alcaline

74 Quel est le couple cellules-virus

75 Les cellules hôtes Lignées Origine Utilisation Sf-9 Sf-21 Hi-5 Tri-Ex
Spodoptera frugiperda (tissu ovarien de pupe) Production de baculovirus recombinant Expression intracellulaire Sf-21 Production de protéines intracellulaires Sécrétion Hi-5 Trochoplusia ni (cellules ovariennes) Tri-Ex Dérivées de Sf-9

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77 Le système d’expression (BEVS)
Développé en 1982, Summers et Smith Remplacement du gène non essentiel très tardif de la polyhédrine par le transgène Utilisation du promoteur précoce (le1) ou très tardif (p10, pPolyh) Utilisation de séquence signal pour la sécrétion (HBM et gp67) Les modifications de confort du génome : facilité le système.

78 Principe historique

79 Criblage des virus recombinants
Cellules: Sf9, 3 jours après infection

80 Bac-to-Bac (InvitrogenTM)

81 Obtention des Virus recombinants pour la production

82 Quels sont les paramètres qu’il faut optimiser avant de passer à la production?

83 Optimisation de l’expression
MOI

84 Optimisation de l’expression
Température: croissance et viabilité des cellules

85 Optimisation de l’expression
Température: expression/stabilité de la protéine recombinante

86 Optimisation de l’expression
Cellules hôtes et sécrétion

87 Purification de protéines taggées

88 Production de protéines recombinantes

89 Bioréacteurs

90 Bioréacteurs

91 Bioréacteurs 300 litres

92 Bioréacteurs

93 Purification