Expression du Génome Le transcriptome.

Présentation au sujet: "Expression du Génome Le transcriptome."— Transcription de la présentation:

1 Expression du Génome Le transcriptome

2 Déchiffrage de l’Information Génique
L’information est encodée dans la séquence de nucléotides contenus dans des unités discrètes Les gènes L’information contenue dans les gènes est transcrite pour générer les ARNs puis décodée pour générer les protéines

3 Les Gènes Seulement un des deux brins d’un gène est codant! Exons
Site d’initiation de la transcription Region 3’ nontraduite Region 5’ nontraduite Introns Promoteur/ Region régulatrice 5’ Séquence de terminaison 3’ Transcrit d’ARN Exon 2 Exon 3 Int. 2 Exon 1 Int. 1 Exons Seulement un des deux brins d’un gène est codant!

4 Codant Brin Codant Brin positif Brin sens
Brin complémentaire à la matrice Brin dont la séquence est la même que celle de l’ARN transcrit Brin sur lequel se retrouve le promoteur 4

5 Non Codant Brin non Codant Brin négatif Brin anti sens Brin matrice
Brin dont la séquence est complémentaire à celle de l’ARN transcrit 5

6 Codant Vs Non-codant ADN: 5’ TAG 3’ 3’ ATC 5’ Transcription ARN: ? 5’
Traduction Leu Protéine: Code génétique: CUA = Leu UAG = Arrêt

7 Transcription - Traduction
Brin matrice 3’ Brin codant 5’ Brin sens 5’ NH3— — COOH

8 ORFs Toutes les séquences double brins ont nécessairement 6 cadre de lectures GCCGATTAGAGA> TGCCGATTAGAG> ATGCCGATTAGA> 5’-ATGGCGATTAGAGACAGCCATTAA-3’ 3’-TACTGCTAATCTCTGTCGGTAATT-5’ <CTGTCGGTAATT <TCTGTCGGTAAT <CTCTGTCGGTAA Combien d’ORFs est-ce que cette séquence possède?

9 Homologues Séquences de gène qui possèdent un ancêtre commun
Les Homologues partage un niveau d’identité élevée Identité Pourcentage de bases ou d’acides aminés qui sont les mêmes entre différentes séquences

10 Homologue Nucléotidique
Séquences dont l’identité est plus élevée que 70% Ex. Un homologue de l’hémoglobine humaine dans le soya G.G.T.G.A.G.G.G.T.A.T.C.A.T.C.C.C.A.T.C.T.G G.G.T.C.A.G.G.A.T.A.T.G.A.T.T.C.C.A.T.C.A.C * * * * * * * * * * * * * * * * 77% identité

11 Homologues protéiques
Séquences protéiques avec plus de 25% d’identité Ex. Une protéine homologue de l’hémoglobine humaine se retrouve dans le soya G A R G G W L G.G.T.G.A.G.G.G.C.A.T.C.A.T.C.C.C.A.T.C.T G.G.T.C.A.G.G.A.C.A.T.G.A.T.T.C.C.A.T.C.A G T P M I W E Pourcentage d’identité: 28%

12 Homologues Orthologues : Paralogues :
Homologues retrouvé dans différents organismes qui ont ancêtre commun Duplication suivie spéciation Paralogues : Homologues retrouvé dans la même espèces Duplication avant la spéciation

13 Mutations

14 Mutations Ponctuelles
Faux Sens - Neutre Synonyme/Silencieuse : Changement de base qui ne change PAS l’acide aminé Ex. AGG → CGG tous deux Arg Faux Sens - Non-Synonyme - Conservée: Changement de base qui change l’acide aminé pour un autre semblable Même charge et forme Ex. AAA → AGA Lys à Arg tous deux sont basiques

15 Mutations Ponctuelles
Faux Sens - Non-Synonyme – Semi-conservée: Changement de base qui change l’acide aminé à un semblable Même forme différente charge Ex. CGC → CUC Arg (Polaire) à Leu (non polaire) Faux Sens - Non-Synonyme – Non-conservée: Changement de base qui change l’acide aminé à un différent Différente forme et charge

16 Mutations Ponctuelles
Non Sens Changement de base qui crée un codon stop prématuré dans l’ORF Cause l’arrêt prématuré de la traduction Protéine tronquée Indel – Insertion ou délétion d’une seule base dans l’ORF: Change le cadre de lecture Change la séquence protéique Peut causer l’arrêt prématuré de la traduction

17 Répertoire d’ARN des gènes qui codent pour des protéines
Génome Transcription Transcriptome Répertoire d’ARN des gènes qui codent pour des protéines Répertoire d’ARN qui représente la fraction du génome qui est exprimée Traduction Protéome Répertoire de protéines dérivées du transcriptome

18 Un Génome Le transcriptome est-il le même dans toutes les cellules d’un organisme? Le transcriptome est-il toujours le même dans une cellule donnée?

19 Est-ce qu’une Séquence Code pour un Transcrit?
Analyse d’hybridations northern  RT-PCR 

20 Comparaison des Méthodes
Northern RT-PCR Séquence doit être connue Non Oui Présence ou absence d’un transcrit Oui Oui Permets de déterminer la taille Oui Non Sensibilité Faible Élevée Comparer l’abondance relative Oui Oui Obtenir la séquence du transcrit Non Oui Déterminer quel brin d’ADN est transcrit Oui Oui Déterminer combien de transcrits sont fait à partir d’une séquence Oui Non LA SÉQUENCE DOIT ÊTRE EXPRIMÉE OUI OUI

21 Analyse northern Isoler l’ARN total de cellules ou d’un tissu
Séparer les ARN d’après leurs grosseurs sur gel d’agarose dénaturant Formaldéhyde + Formamide Hybridation avec une sonde complémentaire ARNr ARNt

22 Hybridation northern Nécessite une sonde
Hybridation = la sonde possède des séquences d’un gène La séquence est exprimée Intensité du signal d’hybridation = abondance relative Nombre de signaux d’hybridation = nombre de transcrit Possiblement nombre de gènes

23 Hybridation northern Permet de comparer la quantité relative d’un transcrit Sensibilité faible Requiert un témoin interne Gène dont l’abondance est constante sous les différentes conditions examinées Témoin pour les variations de la quantité d’ARN chargé Utilise des gènes domestiques : Gènes qui assurent les fonctions indispensables à la vie de tous les types de cellules Expression constitutive

24 La normalisation

25 Problème Un northern d’ARN isolé de différents tissus a été sondé avec le gène Fos et le gène domestique actine. Expliquer les résultats obtenus Tissus: F C R P Actine Fos

26 RT-PCR Permets d’amplifier une séquence d’ARN
Isoler l’ARN total de cellules ou d’un tissu Transcrire les ARN en ADNc avec transcriptase inverse Amplifier par PCR la séquence d’intérêt

27 Réaction de Transcriptase Inverse Gène Non-Spécifique
AAAAAAA ARNm AAAAAAA TTTT Transcription d’ADNc T.I. AAAAAAA TTTT Appariement d’amorce polyT Collection d’ADN complémentaire aux ARNm exprimés à un temps donné sous une condition donnée

28 Réaction de Transcriptase Inverse Gène Spécifique
AAAAAAA AAAAAAA Appariement d’une amorce gène spécifique ADN complémentaire à un ARNm d’intérêt AAAAAAA Synthèse d’ADNc T.I.

29 spécifiques à une séquence d’intérêt
RT PCR Collection d’ADNc ADNc d’ARN d’intérêt PCR avec des amorces spécifiques à une séquence d’intérêt Analyse sur gel

30 RT-PCR La séquence doit être connue pour la conception d’amorces
Produit d’amplification = Les séquences des amorces font partie d’un gène La séquence est exprimée Intensité du produit d’amplification = abondance relative La taille du produit d’amplification n’est pas égale à la taille du transcrit

31 Les Séquences et leurs Propriétés

32 Nucléotides ADN A, T, G, C ARN A, U, G, C

33 Appariement Les acides nucléiques peuvent s’apparier avec leur complément inverse Deux forces opposés influencent l’appariement Liaisons hydrogène favorisent l’appariement Groupement phospahtes favorisent la dénaturation

34 Appariement-température de fusion (Tm)
Le Tm est la température à laquelle 50% des molécules sont simple brin (ou double brin) Le Tm est une fonction du: Pourcentage G:C Composition ionique de l’environment Le pourcentage de complementarité Estimé du Tm =2(#A:T) + 4(#G:C)

35 Tm Vs pourcentage G:C % Double Brin Température (C) (38%) G+C (52%)
50 100 (38%) G+C (52%) (58%) (66%) % Double Brin Température (C)

36 Tm Vs Conc. d’ions Positif
(0.1M NaCl) 50 100 (0.2M NaCl) (0.5M NaCl) % Double Brin Température (C)

37 Tm Vs pourcentage de Complémentarité
(25%) 50 100 (50%) (100%) % Double Brin Température (C)

38 Stringence Pourcentage de complementarité requise pour permettre la formation de duplex stable Le Tm influences les conditions de stringence qui permettent l’appariement Une stringence élevée requière un degré de complémentarité élevée GATCCGGTTATTA vs GATCCGGTTATTA CTAGGCCAATAAT CTTGGACGATAAT

39 Paramètres qui influencent la stringence
 [Sel] = Stringence élevée  Température = Stringence élevée [Sel] = ?  Température = ?

40 4. Hybridation avec Sonde Libre
Lavage

41 Détection : Autoradiographie

42 Propriétés de la Sonde Complémentarité Complète ou partielle?
Complète; idéale; 100% complémentaire Partielle continue; acceptable 100% complémentaire Partielle discontinue; plus difficile Complémentarité partielle

43 Stringence d’Hybridation

44 La Sonde Molécule d’ADN ou d’ARN étiquetée Simple brin Double brin
Brin spécifique (sens spécifique) Double brin Brin non spécifique (sens non spécifique)

45 Sonde Étiquetée à la Digoxygénine
Détection indirecte Film rayons X S Y ENZ Ac-Dig conjugué Peroxydase D Sonde + Dig Cible Membrane

46 Signaux d’Hybridations
Spécifique Non spécifique Bruit de fond Liaison de la sonde à la membrane Liaison de l’Ac à la membrane