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Plusieurs types de division cellulaire Cellules somatiques Cellules humaines en culture Embryon de Xenope apr è s 4-5 divisions au stade 8-10 blastom è

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Présentation au sujet: "Plusieurs types de division cellulaire Cellules somatiques Cellules humaines en culture Embryon de Xenope apr è s 4-5 divisions au stade 8-10 blastom è"— Transcription de la présentation:

1 Plusieurs types de division cellulaire Cellules somatiques Cellules humaines en culture Embryon de Xenope apr è s 4-5 divisions au stade 8-10 blastom è res (ou cellules) Premi è re division m é iotique chez un Ovocyte humain, Xenope, etoile de mer … Cellules embryonnaires Cellules germinales : ovocytes 1mm Vésicule germinale (noyau) 1mm Globule polaire division Levures Figure 1.1

2 Embryon précoce de Drosophile 8 minutes Embryon précoce de Xenope 30 minutes Embryon précoce dOursin60 minutes Schizosaccharomyces pombe ou levure du boulanger ou « fission yeast » 60 minutes Saccharromyces cerevisiae ou levure de bière ou « budding yeast »90 minutes Cellule humaine en culture18 heures Figure 1.2 : Durée des divisions cellulaires dans divers types de cellules.

3 Figure : Evènements observables durant les phases du cycle cellulaire. Cytocinèse Télophase Anaphase Métaphase Prophase Prométaphase Croissance Croissance et réplication de lADN Croissance et Derniers préparatifs en vue de la division S G2 M G1 Phase Go Point de restriction

4 Interphase Métaphase Interphase noyau réticulum endoplasmique golgi Dans les cellules HeLa environ 130 vésicules (ou fragments de golgi) dun diamètre moyen de 60 nm se dispersent dans le cytoplasme. Des vésicules mixtes de membranes denoyau et de reticulum de forment. En fin danaphase les membranes vésiculaires mixtes de noyau et de réticulum se reforment progressivement à partir de leur organisation autour de la chromatine. Les vésicules de golgi fusionnent pour reformer lorganite. Figure : Devenir des organites au cours de la division cellulaire.

5 Figure 1.4 : Variations des types de cycle cellulaire et des cellules produites. G1 S G2 M SM M S Nombre de chromosomes divisés par deux Nombre de chromosomes multipliés par deux Volume cellulaire divisé par deux ABCDABCD

6 Figure 1.5 : Succession des types de cycle cellulaire. G1 S G2 MSMMM Méiose Mitose de lembryon précoce Mitose de lembryon et adulte

7 Figure 1.6 : Place du Cycle cellulaire dans les destins cellulaires. Cycle de division cellulaire C A B D F E Quiescence ou phase G0 Différenciation Z Z Apoptose (ou mort cellulaire programmée) Sénescence post-réplicative Cellule musculaire multinucléée Cellules polarisées en brosse de lépithelium du tube digestif Fragmentation de le membrane plasmique Fragmentation de lADN nucléaire Dégradation lente des fonctions cellulaires suivie de nécrose cellulaire

8 ABAB G1, S ou G2 M M G1 S S + = Figure 1.7 : Dominance cellulaire : Expériences de Rao et Johnson, ADN en réplication (incorporation de BrdU) ADN Métaphasique condensé ADN Interphasique: Chromatine

9 Figure 1.8 : La maturation méiotique chez quelques espèces et les étapes de fertilisation provoquant laccomplissement de la méiose. VG Fertilisation chez : Ascaris (nématode) Spisula (bivalve) Octopus (poulpe) Urechis (ver marin) Fertilisation chez : Chaetopteres (ver marin tubulaire) Mytilus (moule) Patella (patelle ou Bernique) Artemia (crustacé marin) Drosphila (mouche du vinaigre) Ascidia (tunicier marin ou violet) Fertilisation chez Presque tous les vertébrés Fertilisation chez : Arbacia (oursin) Tubularia (hydrozoaire) ChromosomesFuseau 1er globule polaire 2ème globule polaire Noyau haplo ï de = pronucleus Vésicule germinale=VG = noyau de lovocyte Rupture de la vésicule germinale = GVBD Prophase I = Arrêt en G2 = Ovocyte immature GVBD = Germinal Vesicle Break Down = Ovocyte mature Metaphase IMetaphase IIPronucleus = Phase G1 Arrêt m é iotique primaireArrêts m é iotiques secondaires

10 Figure 1.9 : Déclenchement hormonal de la maturation méiotique chez quelques espèces modèles. GVBD 17, 20 -dihydroxy 4-pregnen 3-one (Nagama et Adachi, 1985) Progestérone (Fortune et al., 1975 ; Godeau et al., 1978) 1-Methyladenine (Kanatani et al., 1969) Poisson rouge Rana pipiens; Xénope Etoile de mer Protéases (fluide digestif) (Peaucellier, 1977) Sabellaria alveolata GVBD VG Vésicule germinale=VG = noyau de lovocyte Rupture de la vésicule germinale = GVBD Phase G2Phase MI Déclencheur de la maturation méiotique

11 GVBD Progestérone VG G2 M Figure 1.10 : Emergence du concept MPF (Maturation Promoting Factor) après transfert de cytoplasme dovocytes activés par lhormone de maturation chez diverses espèces. GVBD Progestérone VG G2 M GVBD 1-Methyladenine VG G2 M VG G2 GVBD M VG G2 GVBD M VG G2 GVBD M Crapaud (Bufo sp.) (Dettlaf, 1964) Grenouille (Rana pipiens) (Masui et Markert, 1971; Smith et Ecker, 1971) Etoile de mer (Kishimoto et Kanatani, 1976) MPF Hormone induisant la maturation méiotique Vésicule germinale=VG = noyau de lovocyte Rupture de la vésicule germinale = GVBD ABCABC

12 Incubation dans un milieu contenant du cycloheximide = blocage des traductions de protéines. VG G2 GVBD M Figure : Découvertes des propriétés du MPF (Maturation Promoting Factor) par Yoshio Masui et Clement Markert chez Rana pipiens (1971). C VG G2 Progestérone VG G2 Pas de maturation méiotique VG G2 VG G2 VG G2 Pas de maturation méiotique A B GVBD Progestérone VG G2 M VG G2

13 GVBD M Figure : Découvertes des propriétés du MPF (Maturation Promoting Factor) par Yoshio Masui et Clement Markert chez Rana pipiens (1971). D E GVBD Progestérone VG G2 M VG G2 Traitement du cytoplasme contenant le MPF par des enzymes (DNase RNAse) ou dialyse. GVBD Progestérone VG G2 M VG G2 Traitement du cytoplasme contenant le MPF par des Protéases ou la chaleur. VG G2 Pas de maturation méiotique

14 GVBD 100% Progestérone 1-Methyladenine Masui et Markert, 1971 Grenouille (Rana pipiens) VG G2 M VG G2M GVBD 69% VG G2M GVBD 91% VG G2M GVBD 75% GVBD 100% Kishimoto et Kanatani, 1976 Etoile de mer VG G2 M VG G2M GVBD 100% VG G2M GVBD 88% VG G2M GVBD 93% Figure 1.12 : Résumé des expériences de « transferts de cytoplasmes dovocytes activés » en série dans deux modèles détude (le pourcentage dovocytes receveurs qui atteignent le stade GVBD est indiqué). A B

15 Figure 1.13 : Principe du test MPF de Masui et Markert Rana pipiens (1971). G2 MI MII fertilisation 1ère Mitose 2ème mitose VG MPF ? VG G2 M [MPF] = concentration de MPF 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Divisions embryonnaires Maturation de lovocyte ProgestéroneFertilisation minutes Embryon 2 cellules

16 Figure : Principe des tests MPF et CSF de Masui et Markert chez Rana pipiens (1971). GVBD M Progestérone VG G2 M VG G2 Test MPF Test CSF fertilisation MPF CSF contrôle MPF ?

17 Figure : Activité MPF et CSF mesurables au cours de la maturation méiotique par transferts de cytoplasmes dans des ovocytes ou des blastomères dembryons précoces de. grenouille (Rana pipiens ) par Masui et Markert (1971). Activité MPF Activité CSF Arrêt G2 Meïose I Meïose II 1er cycle 2ème cycle embryonaire embryonaire G2 MI MII fertilisation VG Temps

18 Figure 1.15 : Chronogramme de lidentification du MPF. AnnéeModèle méiotiqueModèle somatiqueModèle embryonnaire Découverte de la transformation automatique dun ADN exogène en ADN dovocyte (Dominance) après microinjection (Oursin, Amphibien). Synchronisation du cycle cellulaire chez Tetrahylmena. Découverte de lhormone de maturation des amphibiens. Découverte de lhormone de maturation de lEtoile de mer Dominance des phases S et M du cycle cellulaire (Cellules HeLa) Découverte du MPF (Amphibiens) Découverte du CSF (Amphibiens). Premiers mutants cdc de S. cerevisiae (Levure) 1974 Premiers mutants cdc de S. pombe (levure)1975 Gene Cdc2 requis pour lentrée en phase M de S. pombe (Levure)1976 Découverte du MPF dEtoile de mer. Elévation des phosphorylations de protéines au cours de lentrée en méiose (Etoile de mer) Nécessité dATP pour lactivité MPF. Universalité du MPF en méiose Identification et clonage de la 1ère Cycline (Oursin). Découverte du MPF dans cellules HeLa et chez S. cerevisiae Les gènes cdc2 (S. pombe) et CDC28 (S. cerevisiae) sont équivalents Oscillations parralèles du MPF et des phosporylations de protéines (Etoile de mer) Nécessité de synthèses de protéines au MPF pour pouvoir se régénérer (Xenope) Découverte du MPF en mitose (Xenope) Les gènes CDC28 et cdc2 codent pour une protéine kinase (Levures). Clonage du gène cdc2 humain Purification du MPF de Xenope Purification du MPF (Xenope). Purification de lHistone H1 kinase (Etoile de mer) Identification de cdc2 dans le complexe MPF-H1 kinase de Xenope et dEtoile de mer (western blot). Le MPF = complexe stoechiométrique entre une sous-unité cycline et une sous-unité P34cdc2 (Etoile de mer) Homologues de cdc2 identifiés dans divers modèles et adoption dune nouvelle nomenclature des protéines da la famille de cdc2= CDK Paul Nurse, Leland Hartwell et Tim Hunt partagent ensemble le prix Nobel de Médecine pour leurs découvertes respectives des régulateurs de la division cellulaire.

19 Figure : Expérience didentification de la première cycline dans lembryon dOursin (Arbacia punctulata), Tim Hunt Fertilisation des ovocytes dans leau de mer en présence de [35S]methionine pour marquer les néo-synthèses de protéines. Collecte déchantillons toutes les 10 minutes et traitement dans lacide trichloroacetique pour fixation puis migration sur gel SDS-PAGE, séchage et autoradiogramme. Cycline Protéines radioactives SDS-PAGE Densitométrie de la cycline Le second pic de synthèse de Cycline est moins important à cause de la dilution de la [35S]methionine rajoutée au début de lexpérience Minutes

20 Figure : Expérience didentification de la première cycline dans lembryon dOursin (Arbacia punctulata), Tim Hunt Fertilisation des ovocytes dans leau de mer en présence de [35S]methionine pour marquer les néo-synthèses de protéines. Collecte déchantillons toutes les 10 minutes et traitement comme pour la Figure Quantité de Cycline (- -) % dembryons en division ( ) Heures après fertilisation

21 Figure 1.17 : Mutants cdc de Levure (Schizosaccharomyces pombe) isolés par Paul Nurse à partir de 1976 : Réseau de régulation en amont de cdc2. CDC2 kinase Légende : Effet inhibiteur Délétion du gène Effet activateur Surexpression du gène Phénotype de division normal Phénotype de division Wee Phénotype de division cdc25 Phénotype de division de type catastrophe mitotique = Entrée en phase M avant la fin de la phase S = Totale désynchronisation des phases S et M. wee1 cdc25

22 Figure 1.18 : Clonage de lhomologue humain de cdc2 par complémentation focntionnelle, Lee et Nurse, Banque dADNc humains (Labo. Hirota Okayama) Culture de mutant cdc2ts de S. pombe À la température permissive= divisions Transfection des levures cdc2ts avec lADN de la banque Observation des colonies de Levures cdc2ts à T° restrictive Repiquage des colonies de levures qui arrivent à pousser Observation au microscope dune colonie de Levure à T° restrictive. Levure de grande taille ayant perdu le plasmide et incapable de se diviser = phénotype cdc2ts. Levures de taille normale sans phénotype cdc2ts = phénotype normal. Isolement et séquençage du plasmide de la banque dADNc Humain présent dans le clone de Levure. N- -C Cdc2 Levure N- -C Cdc2 Humain Identification du produit codé par lADNc responsable de la complémentation fonctionnelle de la mutation cdc2ts (perte de fonction) par comparaison de séquence aminoacides. 63% didentité


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