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Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon Cours d'Hémostase DUT ABB 1- Physiologie de l'Hémostase.

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1 Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon Cours d'Hémostase DUT ABB 1- Physiologie de l'Hémostase

2 PHYSIOLOGIE DE LHEMOSTASE Ensemble des différents mécanismes assurant: -la prévention des saignements spontanés -larrêt des hémorragies en cas de lésion vasculaire -le maintien de la fluidité sanguine -une participation dans les phénomènes de cicatrisation

3 LHémostase: 3 étapes inter-dépendantes qui se déroulent de façon concomitante - Hémostase primaire: aboutit formation dun agrégat plaquettaire (« thrombus blanc »), permet seul larrêt des s aignements dans les capillaires les plus fins - Coagulation plasmatique: aboutit par la formation dun réseau de fibrine, à la consolidation de lagrégat plaquettaire - Fibrinolyse: permet la lyse du caillot fibrino-érythro- plaquettaire, et le maintien de la perméabilité vasculaire, une fois la cicatrisation du vaisseau achevée

4 Hémostase primaire Coagulation plasmatique Fibrinolyse Plaquettes + Facteurs de la Coagulation Inhibiteurs physiologiques de la coagulation Activateurs du plasminogène Inhibiteurs physiologiques de la fibrinolyse LHémostase: processus localisé et rapide, en équilibre physiologique entre processus coagulant et fibrinolyse, régulés eux-même par des inhibiteurs et des activateurs Ce processus nécessite la coopération entre: -la paroi des vaisseaux sanguins -les protéines plasmatiques, facteurs de la coagulation et de la fibrinolyse -les cellules sanguines, en particulier les plaquettes

5 HEMOSTASE PRIMAIRE Objectif : formation dun agrégat plaquettaire (thrombus blanc) UN TEMPS VASCULAIRE et UN TEMPS PLAQUETTAIRE Facteurs mis en jeu: -paroi vasculaire -plaquettes -protéines plasmatiques

6 Déroulement de lhémostase primaire LESION VASCULAIRE ACTIVATION PLAQUETTAIREADHESION PLAQUETTAIREVASOCONSTRICTIONAGREGATION PLAQUETTAIRE

7 1. VASOCONTRICTION : immédiate dès la rupture du vaisseau -Petits vaisseaux uniquement -Passive (élasticité paroi) puis active par contraction réflexe (sympathique) des muscles lisses -Prolongée et accrue par substances libérées par les plaquettes: adrénaline, sérotonine, TXA2, … Diminution jusquà 40% du Ø du vaisseau Ralentissement du débit sanguin favorisant les interactions entre plaquettes et endothélium

8 2. ADHESION PLAQUETTAIRE au sous-endothélium vasculaire Endothélium vasculaire « non thrombogène » : protéoglycanes tels que héparane sulfate, dermatane sulfate, … Sous-endothelium « thrombogène »: collagène, microfibrilles, élastine, fibronectine Plaquettes: glycoprotéines membranaires (GP) récepteurs - GP Ia/IIa : récepteur collagène - GP Ic/IIa : récepteur fibronectine - GP IIIb : récepteur thrombospondine - GP Ic/IIa: récepteur laminine -GP Ib/IX : récepteur Facteur von Willebrand (vWF) Facteur von Willebrand: glycoprotéine (240kDa) plasmatique, synthèse par ¢ endothéliales et Mk, forme multimères (500 à kDa) 1 domaine de liaison aux fibres de collagène et 1 domaine de liaison à GP Ib/IX plaquettaire

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10 3. ACTIVATION PLAQUETTAIRE Changement de formeLibération granulaire Activation métabolique Inducteurs de lactivation: collagène, ADP endothélial, traces de thrombine Mécanismes biochimiques de lactivation plaquettaire: PiP2DG + IP3 PLC PKC Fusion des granules Mobilisation Ca 2+ Calmoduline Changement forme Sécrétion granulaire PLA2 Acide arachidoniquePL mb PGG2 Cox Txs TXA2vasoconstriction et agrégation plaquettaire

11 Relargage du contenu des granules plaquettaires: centralisation des granules et fusion avec les systèmes canaliculaires ouverts sur lextérieur -granules denses : Ca2+, ATP, ADP, adrénaline, sérotonine, -granules : fibrinogène, fact.V, vWF, PDGF, fibronectine, TXA2 -lysosomes: hydrolases, élastases, collagénases Ces substances, notamment ADP et TXA2, stimulent le recrutement et lactivation de PLT voisines, qui subissent les mêmes modifications morphologiques et métaboliques Changement de forme: discoïdes initialement, PLT deviennent sphériques et volumineuses, et émettent des pseudopodes. Remaniements mb : mécanisme flip-flop des phospholipides anioniques -constitution du « F3P » pour fixation Ca2+ dépendante des facteurs de la Coagulation vit.K dépendant (II,VII,IX,X). -accessibilité de GPIIb/IIIa (capable aussi de fixer vWF)

12 4. AGREGATION PLAQUETTAIRE GP IIb/IIIa mb : récepteur au Fibrinogène permet la formation de ponts « fibrinogène » en présence de Ca2+, entre PLT voisines assurée par lenchevêtrement des pseudopodes dernier stade: fusion des mb PLT entre elles Rq: Dernière phase de lhémostase après coagulation: Rétraction du caillot après la coagulation, les PLT interviennent encore par lactivité de leur protéines contractiles, pour contracter lagrégat et exsuder le sérum retenu

13 5.REGULATION ACTIVATION PLAQUETTAIRE adhésion plaquettaire reste localisée car elle na lieu uniquement que sur sous-endothélium lésé TXA2 rapidement inactivé en TXB2 inactif Cellules endothéliales produisent à partir de lacide arachidonique libéré, de la Prostacycline PGI2: vasodilatateur et anti-agrégant plaquettaire La PGI2 favorise lactivation de ladénylate cyclase ATPAMPc Laugmentation dAMPc favorise le stockage du Ca2+ dans les structures tubulaires denses des PLT, donc diminue lagrégation plaquettaire

14 6. EXPLORATION DE L HEMOSTASE PRIMAIRE Mesure du Temps de Saignement – TS -: explore lhémostase primaire dans son ensemble, vaisseau + plaquettes + protéines. Temps nécessaire à larrêt saignement provoqué par une petite coupure cutanée au niveau des vaisseaux superficiels. -Méthode dIvy: avant-bras, 3 points de piqûre ou incision 1cm, sous pression 50 mmHg. TS < 10 min. -Méthode de Duke (moins reproductible, moins sensible): lobe de loreille, incision.TS < 5 min. Lallongement du TS: anomalie quantitative ou qualitative des plaquettes, anomalies vasculaires, anomalies des facteurs plasmatiques Numération Plaquettaire: Risque Hémorragique PLT < /mm 3 mais rarement hémorragie grave sauf si PLT < /mm 3 en association avec anomalie hémostase ou lésion viscérale

15 Mesure du Temps dOcclusion sur PFA-100 Dade-Behring Analyseur reproduisant lenvironnement dun vaisseau lésé: -réservoir de sang total citraté -mb nitrocellulose enduite : Collagène + ADP ou +Adrénaline -capillaire 200µm abouché à la membrane percée dun orifice 150µm, qui simule la brèche vasculaire Méthode: -Passage du sang total par le capillaire (800 à 1000µl) et par lorifice de la membrane (sous aspiration constante créant des forces de cisaillement représentant lhémodynamique dune artériole). -Adhésion et agrégation des PLT sur la membrane et entre elles, réduction du flux sanguin jusquà obstruction orifice et larrêt du flux. -Mouvement du sang à travers lorifice mesuré par microprocesseur Mesure dun Temps dOcclusion: capacité fonctionnelle des plaquettes à constituer un agrégat, méthode alternative à la mesure du TS in vivo Plus sensible et reproductible que TS, permet un bon dépistage du déficit en vWF, et est plus sensible que TS à la baisse de lagrégation induite par un traitement à laspirine

16 Le tandem collagène – ADP [valeurs N = 70 – 110 sec (m = 90)] détecte mieux que le TS, les déficits en vWF, cause la plus fréquente danomalie constitutionnelle de lhémostase (allongement pratiquement constant du test collagène – ADP) Le tandem collagène – adrénaline [valeurs N = 100 – 170 sec (m = 130)] dépiste bien le traitement à laspirine. Il est ici aussi meilleur que le TS (par contre le PFA – 100 détecte mal les prises de clopidogrel ou de ticlid) NB : quelques restrictions demploi à ce test sur appareil : Hte 4 heures

17 Tests complémentaires Adhésivité PLT: sur billes de verre ou sur sous-endothélium animal, peu réalisé Agrégation PLT in vitro: turbidimétrie à 37°C sur PRP, ou sur PLT lavées en suspension agitée, en présence dagents inducteurs tels que ADP, Acide arachidonique, collagène, thrombine, ristocétine. La transmission lumineuse de la suspension augmente lorsque se forment les agrégats. Activation PLT: dosage substances libérées sous stimulation: ADP, ATP, thromboglobuline, PF4, TXB2… Dosage Facteur von Willebrand: - dosage immunologique avec Ac spécifiques vWFAg : ELISA, Latex, Laurell - dosage fonctionnel vWFRCo (activité cofacteur de la ristocétine) mesure turbidimétrique de lagrégation de PLT normales lavées en présence du plasma du patient et dun inducteur de lagrégation, la ristocétine Dosage Fibrinogène: chronométrique ou immunologique

18 Mesure de la résistance capillaire : exploration qualité des vaisseaux résistance des parois des capillaires cutanés à une dépression dintensité variable: dépression 10 cm Hg par ventouse au pli du coude pendant 5 min., dénombrement du nombre de pétéchies. Fragilité capillaire si nbre de pétéchies > 5 Recherche des GlycoProtéines membranaires des PLT: par cytométrie de flux, à laide dAc spécifiques marqués par des fluorochromes

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20 7. PATHOLOGIES DE LHEMOSTASE PRIMAIRE TS allongé Dosage Fibrinogène Dosages vWF Patient : Prise médicamenteuse ? Tests Fonctionnels PLT Num.PLT Résistance capillaire Thrombocytoses: associées SMP, asplénies, hémorragies, hémolyses, anémies microcytaires hypochromesrisque thrombotique Atteintes vasculaires: Fragilité capillaire Thrombopénies Thrombopathies Maladie de Willebrand syndromes hémorragiques cutanés et muqueux

21 7.1 Maladie de WILLEBRAND La plus fréquente des maladies hémorragiques constitutionnelles: incidence 10-15/105 habitants, Prévalence 1 à 2 % -Transmission autosomale (chr12) dominante le + svt, sauf dans la forme la plus sévère qui est de transmission récessive -Syndrome hémorragique cutanéo-muqueux (ecchymoses, épistaxis, hémorragies viscérales…) dintensité extrêmement variable selon le niveau de déficit, selon lâge,… -3 grands types de Déficits en vWF: *type 1:quantitatif partiel, le + fréquent 70%-80% des patients *type 3: quantitatif quasi-total, le + grave, 3% des patients *types 2: qualitatifs, 4 variants, 21 sous-types 2a: absence de multimères, diminution affinité pour PLT 2b: multimères absents dans plasma, mais présents dans PLT, hyperaffinité pour GPIb 2M: diminution affinité pour PLT 2N: anomalie de liaison au VIII Rq: vWF transporteur VIII plasmatique: si déficit primaire en vWF, très souvent déficit secondaire en VIII

22 TS TQ-TP% TCA VIII vWFAg vWFRCo Maladie de Willebrand type 1 ou 3 Hémophilie A Allongé(ou Normal)NormalNormalAllongé DiminuéDiminué ou Nul Diminué ou NulNormal 2 maladies hémorragiques constitutionnelles de lHémostase les plus fréquentes: symptômes cliniques peu différents

23 Type 1Types 2Type 3 TSA (ou N)A ou NA VIIIDD ou ND vWFAg DD ou NNul vWFRCoDTrès D (2a,2b) ou NNul Agrégation PLT à Ristocétine DD (2a), ou A (2b) ou NNulle Multimères plasma NAnx (2a,2b) ou N- Multimères PLTNAnx (2ae1) ou N- Fixation GPIbND (2a,2M) ou A (2b) ou N- Fixation au VIIINN ou D à Nulle (2N)- Diagnostics différentiels types Willebrand (A: allongé, N: normal, D: diminué, Anx: anormaux)

24 Traitement Willebrand - augmentation libération vWF par cellules endothéliales pour type 1 et certains types 2 (sauf 2b) par DDAVP (analogue de la vasopressine) - substitution par injection de concentrés plasmatiques VWF viro-inactivés Prophylaxie des hémorragies: contre-indication de laspirine, ou anti-agrégants PLT, et de certains anti-inflammatoires.

25 7.2 Atteintes VASCULAIRES: purpuras (pétéchies hémorragiques cutanés) -constitutionnel héréditaire: Maladie de Rendu-Osler -infectieux: Méningocoque, virus, parasites… -immuno-allergique médicamenteux: pénicilline, aspirine,sulfamides -rhumatoïde ou associé à dautres MAI

26 7.3 THROMBOPENIES (attention fausses thrombopénies dues à EDTA, prélèvement Citrate) -Origines centrales: aplasie, hémopathies malignes, métastases, virus, intox.alcoolique aiguë, benzène médicaments (chimiothérapie,antiviraux, radiothérapie, …) -Périphériques: * par consommation: ~ CIVD: Coagulation IntraVasculaire Disséminée ~Microangiopathies (Purpura Thrombotique Thrombopénique, Syndrome Hémolytique et Urémique, HELLP syndrome) ~iatrogène (Circ.Extra-Corporelle., transfusion massive…) * par anomalie de répartition: ~hypersplénisme (le plus svt associé à cirrhose alcoolique en France) CIVD et Purpura fulminans à Méningocoque

27 * par destruction immunologique : Ac anti-mb PLT ~ Purpura Thrombopénique Auto-Immun –PTAI- : -isolé, considéré comme idiopathique (PTI) ou -associé à MAI, Hémopathie maligne, virus ~ immuno-allergique: HEPARINE, quinine, digitaline, sulfamides, sels dor, methyldopa… ~ allo-immunisation: (groupes plaquettaires) thrompopénies néonatales (allo-Ac anti-PLT dorigine maternelle) et thrombopénies post-transfusionnelles Ac le + fréquent : anti-HPA1a

28 7.4 THROMBOPATHIES : anomalies qualitatives fonctionnelles * acquises les + fréquentes: - associées aux SMP, SMD, … - médicamenteuses: ASPIRINE, PENICILLINE, Ticlopidine, Dipyridamole,… * constitutionnelles: rares (1/10 Millions) - Dystrophie de Bernard-Soulier: déficit GP Ib-IX - Thrombasthénie de Glanzmann: déficit GP IIb-IIIa - Maladie du pool vide: diminution contenu granules denses - Syndrome des Plaquettes grises: diminution contenu granules - Déficit en Cyclo-oxygénase Perturbation des tests dagrégation in vitro des PLT des patients aux différents agents inducteurs

29 Réponses plaquettaires typiques à différents agents inducteurs en PRP

30 agoniste Glanzma nn (GP IIb- IIIa) Bernar d Soulier (GP Ib) Pseudo- Willebra nd Déficit en granule s denses Déficit granule s (PLT grises) Syndro me "Aspirin- like" Anomal ie récepte ur ADP "Ticlopi -din- like" Déficit GP Ia- IIa ADP nulle NNDiminué e et réversibl e NRéversibl e (abs. 2 ième vague) Diminué e N Collagèn e nulle NNPresque nulle diminuéeDiminuée ou nulle Diminué e Nulle Ac. Arachi- donique nulle NNDiminué e parfois N NNulleN ou dim. N Ristocéti ne Présente mais diminuée NulleHypoagr ég. à faible dose NNNNN adrénali ne nulle NNNNAbs. 2 ième vague NN Tableau synthétique des principales anomalies des tests dagrégation plaquettaire

31 LA COAGULATION Deuxième étape de lhémostase, conduisant à la formation de fibrine, permettant de consolider lagrégat plaquettaire Implique des facteurs plasmatiques, des protéines de linflammation, des phospholipides, du Ca 2+ 1-Propriétés des Facteurs de la Coagulation -synthèse majoritairement hépatique -désignés par chiffres romains, et suffixe « a » sous forme activée -Facteurs Vitamine K dépendants nécessite lintervention de la vit.K, pour une synthèse sous forme fonctionnelle: II, VII, IX, X Modification post-traductionnelle: carboxylation de résidus Acide Glutamique (GLU) de la chaîne protéique, par une carboxylase utilisant la vitK comme cofacteur enzymatique

32 Les -carboxyglutamates (GLA) formés, situés dans la région N- terminale, confèrent à ces facteurs la propriétés de fixer le Ca 2+ et de se lier au phospholipides anioniques des mb plaquettaires et cellulaires Labsence de vit.K ou son inhibition provoque la production de facteurs II, VII, IX, X non fonctionnels appelés PIVKA (Protein Induced by Vitamine K Absence or Antagonist)

33 -facteurs du système des kinines inflammatoires: Prékallicréine, Kininogène de Haut Poids Moléculaire KHPM -Facteur Tissulaire appelé aussi Thromboplastine tissulaire: facteur glycoprotéique comportant une partie phospholipidique, synthétisé par de nbx types cellulaires, libéré lors de lésion vasculaire -Du point de vue fonctionnel, les facteurs de la coagulation, sont, soit: -des zymogènes: proenzymes capables dacquérir une activité enzymatique protéolytique (sérine-protéases) par coupure -des cofacteurs de réaction: augmentent la vitesse dactivation du substrat par enzyme, en formant des complexes Enz- Cofacteur-Substrat -un substrat terminal: le fibrinogène

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35 2-Phospholipides et Calcium Phospholipides: -surface catalytique pour activation des facteurs de la coagulation, -permet de concentrer et de faciliter les interactions entre protéines, -permet de localiser laction de la coagulation uniquement au niveau de lagrégat plaquettaire, donc de la brêche vasculaire -PF3: facteur 3 plaquettaire -partie phospholipidique du Facteur Tissulaire Calcium: indispensable à certaines activités enzymatiques, et permet fixation des Facteurs Vit.K dépendants sur phospholipides Prélèvement sur Anticoagulants (Chélateurs du Ca 2+ ) pour obtenir Plasma: EDTA potassique, Citrate de Na +

36 3-Déroulement de la coagulation 3 étapes successives: -la génération dun complexe prothrombinase: 2 voies possibles -la thrombinoformation -la fibrinoformation Génération dun complexe prothrombinase a)voie intrinsèque ou endogène: activation de facteurs de la phase contact PK, KHPM, XII, XI In vivo: surface contact activatrice électronégative du collagène sous-endothélial, et la protéolyse de la PK sur les ¢ endothéliales semblent initier la voie In vitro: surface contact activatrice électronégative type verre, kaolin, silice, provoque changement conformationnel XII -activations successives du XII, XI, IX -formation dun complexe Tenase (IXa,VIIIa)+ Ca 2+ + PF3: activation X

37 b)voie extrinsèque ou exogène: la lésion vasculaire saccompagne dune libération de Facteur Tissulaire -formation dun complexe VII- Ca 2+ -FT, où le VII sactive en VIIa, puis activation du X Thrombinoformation -formation complexe prothrombinase : association Xa + Ca 2+ + Va, liés à surface phospholipidique (mb plaquette PF3, ou FT) -clivages de la Prothrombine II en Thrombine IIa -Thrombine: enzyme puissante, libre, plusieurs rôles -fibrinoformation -activation facteur V, VIII, XIII -participe à lactivation et agrégation plaquettaire dans Hémostase primaire -participe à lactivation de Protéine C (inhibiteur physiologique)

38 Fibrinoformation : Fibrinogène: 6 chaînes polypeptidiques A B identiques 2 à 2 -clivage extrémités N-Terminales des chaînes A B formation de monomères de fibrine -polymérisation des monomères de fibrine par liaisons H: formation de fibrine instable et soluble -stabilisation de la fibrine par liaisons covalentes de transamidation grâce au XIIIa, entre les domaines appelés D (région C- terminales) des monomères: formation de fibrine insoluble

39 Voie exogène Voie endogène IXaIX PL+Ca 2+ Facteur Tissulaire VII + Ca 2+ FT-VIIa X Thrombine IIa Prothrombine II Va Ca 2+ + PL Xa X VIIIa Ca 2+ + PF3 Fibrine Fibrine solubleFibrinogène XIIIa XIaXI XIIaXII KallicréinePréKallicréine Surface électronégative collagène sous- endothélial KHPM XIII V VIII Voie exogène: voie principale in vivo Voie endogène: voie de consolidation

40 4-Les inhibiteurs physiologiques de la coagulation 4-1 Les inhibiteurs des Sérine-protéases (SERPINS) Inhibiteurs protéiques formant des complexes équimoléculaires stables, inhibant site actif (comportant résidus sérine) des facteurs activés AntiThrombine III (ATIII) -glycoprotéine plasmatique, synthétisée par le foie -inhibiteur majoritairement de Thrombine et Xa -inhibiteur modéré de IXa, XIa, XIIa, et Kallicréine -action lente, mais fixation dHéparine sur ATIII, augmente vitesse dinhibition (x2000), doù laction anticoagulante de lHéparine -In vivo, lhéparane-sulfate (glycosaminoglycanne) de la paroi vasculaire, joue le rôle de lhéparine ATIII représente 77% de lactivité dinhibition de la thrombine dans le plasma Cofacteur 2 de lHéparine (HCII): inhibition spécifique de la Thrombine, potentialisée in vivo par le dermatane-sulfate, et lhéparine

41 2-Macroglobuline, 1-antitrypsine, C 1 -Inhibiteur: inhibiteurs modérés Thrombine IIa, Kallicréine et XIIa XIa, XaXIIa, Kallicréine Système de la Protéine C / Protéine S: -Protéine C: zymogène, synthèse hépatique vit.K dépendante -Protéine S: cofacteur, synthèse hépatique, endothéliale, et Mk -Thrombomoduline: protéine mb récepteur de la thrombine sur la ¢ endothéliale IIa Protéine C Protéine Ca Protéine S + Ca 2+ Inactivation Va Inactivation VIIIa Thrombomoduline Cellules endothéliales 4-2 Autres Inhibiteurs

42 Système PC / PS : 3 actions inhibitrices de la coagulation -protéolyse du Va et VIIIa -piège la Thrombine 1 action activatrice de la fibrinolyse: -inactivation de linhibiteur (PAI) du t-PA Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) -synthèse endothéliale et Mk -complexe le Xa, et devient inhibiteur du complexe FT-VIIa

43 5-Lexploration biologique in vitro de la coagulation 5.1-Temps de coagulation sang total in vitro: obsolète 5.2-Temps de Quick TQ -exploration de la fonctionnalité de lensemble des facteurs de la voie exogène et de la voie commune: Fibrinogène, II, V, VII, X -Temps de coagulation à 37°C dun plasma citraté, déplaquetté, en présence de thromboplastine tissulaire et de Ca 2+ -Expressions du résultat: TQ en sec., Taux de Prothrombine TP en %, ou INR (International Normalized Ratio) dans le cas de traitement AVK 5.3-Thrombotest dOwren: peu utilisé, identique au TQ, mais pas influencé par V et Fibrinogène

44 5.4-Temps de Céphaline + Activateur (ou Activée) TCA -exploration fonctionnelle de lensemble des facteurs de la voie endogène et de la voie commune: Fibrinogène, II, V, VIII, IX, X, XI, XII, et PK, KHPM -Temps de coagulation à 37°C dun plasma citraté, déplaquetté, en présence dun substitut phospholipidique plaquettaire, la céphaline, de Ca 2+, et dun activateur des facteurs de la phase contact, silice, kaolin… -expressions du résultat: TCA en sec., ou Ratio TCA patient / témoin 5.5-Temps de Thrombine TT -exploration de la fonctionnalité de létape de fibrinoformation (sauf XIII) -temps de coagulation à 37°C dun plasma citraté, déplaquetté, en présence de Ca 2+, et dune quantité déterminée de thrombine -expression TT en sec.

45 5.7-Dosage du Fibrinogène Dosage chronométrique (dit de von Clauss) du Fibrinogène -dosage indirect, car mesure dun temps dapparition de fibrine par transformation de la totalité du fibrinogène présent -temps de coagulation à 37°C dun plasma dilué, citraté, déplaquetté, en présence de thrombine concentrée, est inversement proportionnel à la quantité de fibrinogène -dosage quantitatif et qualitatif -expression en g/L Dosage immunologique du fibrinogène -en général par immunonéphélémétrie -dosage quantitatif, pas fonctionnel

46 5.8-Dosage chronométriques de facteurs isolés de la coagulation à laide de plasmas déficients -Plasmas réactifs déficients en un seul facteur -Temps de coagulation (TCA ou TQ en fonction du facteur à doser) dun plasma déficitaire est fonction de la quantité du facteur apporté par le plasma à tester -Résultats exprimés en % de facteur par rapport à des plasmas normaux servant détalons 5.9-Dosage colorimétriques ou amidolytiques -utilisation de substrats oligopeptidiques chromogènes: groupement paranitroaniline libère amine pNA par coupure enzymatique -dosage dactivité enzymatique: concentration enzyme (facteur) est proportionnelle à la vitesse dhydrolyse, mesurée par la variation absorbance (dosage pt final, 2 pts, cinétique…) - dosage isolé de chaque facteur, ou des inhibiteurs physiologiques 5.10-Dosage par techniques immunologiques: Immunonéphélémétrie, ELISA -dosage isolé de chaque facteur de la coagulation, ou dinhibiteurs

47 LA FIBRINOLYSE Processus physiologique permettant destruction du caillot de fibrino- plaquettaire qui se déclenche dès que la cicatrisation de la brèche vasculaire est amorcée. 1-Mécanisme -Plasminogène: glycoprotéine plasmatique, synthétisée par foie -Activation plasminogène libère plasmine, qui reste localisée au niveau de la fibrine -dégradation progressive de la fibrine en PDF, de plus en plus courts -tous les PDFibrine contiennent structure domaines D-D appelée D-Dimères (car les liaisons covalentes entre monomères de fibrine ne sont pas rompues par la plasmine) -existence de D-Dimères: preuve de la formation de fibrine stabilisée donc dune coagulation, puis de sa lyse par plasmine FibrineProduits de Dégradation de la Fibrine PDF PLASMINEPlasminogène

48 2- Activation du plasminogène PlasminogènePlasmine t-PA Urokinase Kallicréine t-PA: activateur tissulaire du plasminogène -synthèse endothéliale vasculaire continue, mais libération massive si anoxie tissulaire, traumatisme endothélial, vasoconstriction, stase sanguine, ischémie… -t-PA libre, fixé par fibrine, et forme complexe t-PA-Fibrine- Plasminogène Urokinase: pro-urokinase synthétisée par ¢ rénales, plasmatique, et activée par Kallicréine Kallicréine: facteur système contact de la coagulation Activateur non physiologique: la streptokinase (exo-enzyme S HA)

49 3-Autres actions de la plasmine Dans certaines conditions dactivation, (excès de formation par rapport aux capacités dinhibition, lors de libération massive de t-PA): -action fibrinogènolytique: la plasmine est capable de dégrader du fibrinogène en Produits de Dégradation du Fibrinogène, PDFib, qui ne contiennent pas de structures D-Dimères FibrinogèneFragments X, Y, D, E Plasmine -destruction du VIII, V, XIIIa Rq1: les PDF ont une action inhibitrice sur la coagulation (action anti- thrombine, inhibition de la polymérisation de fibrine, anti-agrégation plaquettaire) Rq2: activation de la fibrinolyse et fibrinogènolyse dorigine leucocytaire (PN), par élastase, et cathepsine

50 4-Régulation de la fibrinolyse Inhibiteurs de lactivation du plasminogène PAI (Plasminogen Activation Inhibitors) -PAI 1 : synthèse par endothélium, PLT, foie, inhibition du t-PA, et urokinase, variations circadiennes (max matin, min soir), augmentation avec âge, grossesse, état inflammatoire -PAI 2 : synthèse placentaire, inhibition urokinase Inhibiteurs de la plasmine - 2-antiplasmine: lie la plasmine libre, et le plasminogène - 2-Macroglobuline, 1-AntiTrypsine, C 1 -Inhibiteur: inhibiteurs modérés

51 5-Exploration biologique in vitro de la fibrinolyse recherche les indices dune hyper-fibrinolyse 5.1-Tests directs Temps de lyse dun caillot de sang dilué: obsolète, trop long Temps de lyse du caillot des « euglobulines » (Test de von Kaulla) « euglobulines » ??: activateurs de la fibrinolyse, fibrinogène, plasminogène -précipitation des euglobulines par dilution plasma et acidification -re-solubilisation en tampon -activation de la coagulation par addition de CaCl 2 et thrombine -mesure du temps de lyse du caillot de fibrine formé: entre 3 et 6H -si < 2H: témoin dune hyper-fibrinolyse Dosage Plasminogène par technique amidolytique Dosage du t-PA, urokinase, par ELISA

52 5.2-Test indirects Recherche et Dosage des PDF (Fibrine et Fibrinogène) -tech. Immuno. par agglutination latex sensibilisé -PDF sériques > 10 mg/L: témoin hyper-fibrino ou fibrigèno-lyse Dosage des D-Dimères -tech. ELISA et tech. Immunoturbidimétrique -D-Dimères sont spécifiques de lactivité de fibrinolyse, donc leur concentration augmentent dans sérum après thrombose, mais aussi lors de circonstances variées (âge, grossesse, cancers, infections, inflammation, post-opératoire…) -utilisation du dosage: dosage à valeur prédictive négative, proche de 100%, dune thrombose si D-Dimères sériques < 500 µg/L, exclusion du diagnostic dun événement thrombotique chez un patient Permet déviter investigations (angiographies, scintigraphies) difficiles, invasives et coûteuses


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